氧感知機(jī)制的揭示有助于多種疾病的治療
——解讀2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

姜繼宗

上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院(籌)，上海 200444

北京時(shí)間10月7日，美國(guó)哈佛大學(xué)教授威廉·凱林(William G. Kaelin Jr.)、英國(guó)牛津大學(xué)教授彼得·拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)和美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)教授格雷格·塞門扎(Gregg L.Semenza)(圖1)分享2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，以表彰他們?cè)诩?xì)胞如何感知和適應(yīng)氧氣供應(yīng)方面的革命性發(fā)現(xiàn)。這讓人們從細(xì)胞分子水平深入地了解機(jī)體感受氧氣的基本原理。諾貝爾獎(jiǎng)官方評(píng)價(jià)他們的工作揭示了生命中最重要的適應(yīng)過(guò)程之一的機(jī)制。

圖1 2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者威廉·凱林(左)、彼得·拉特克利夫(中)和格雷格·塞門扎(右)(圖片來(lái)源：https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2019/summary/)

塞門扎于1956年出生于紐約。1984年他獲得賓夕法尼亞大學(xué)費(fèi)城醫(yī)學(xué)院的醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，并在達(dá)勒姆杜克大學(xué)接受了兒科專業(yè)的培訓(xùn)。他在約翰·霍普金斯大學(xué)進(jìn)行博士后研究，并于1999年成為約翰·霍普金斯大學(xué)的教授。自2003年以來(lái)，他擔(dān)任約翰·霍普金斯細(xì)胞工程研究所血管研究計(jì)劃的主任并于2008年當(dāng)選美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士。其團(tuán)隊(duì)主要研究方向?yàn)檠醴€(wěn)態(tài)的分子機(jī)制、基因和干細(xì)胞療法治療缺血性心血管疾病、HIF-1在腫瘤中的作用等。塞門扎教授是當(dāng)代研究人體感知氧氣調(diào)節(jié)分子機(jī)制的杰出研究者之一，他在解釋細(xì)胞如何適應(yīng)不斷變化的氧氣水平方面作出巨大的貢獻(xiàn)，并且以發(fā)現(xiàn)HIF-1蛋白而揚(yáng)名于世。

拉特克利夫于1954年出生在英國(guó)蘭開(kāi)夏郡。他在劍橋大學(xué)的岡維爾與凱斯學(xué)院學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué)，在倫敦的圣巴塞洛繆醫(yī)院進(jìn)行了臨床培訓(xùn)，之后又在牛津大學(xué)進(jìn)行腎病學(xué)專業(yè)培訓(xùn)。1990年，他在牛津大學(xué)成立一個(gè)獨(dú)立的研究小組，開(kāi)始研究細(xì)胞對(duì)低氧的反應(yīng)。他現(xiàn)在是倫敦弗朗西斯·克里克研究所的臨床研究主任，牛津大學(xué)的靶標(biāo)研發(fā)院主任和路德維希癌癥研究院成員。其研究方向?yàn)榈脱跫?xì)胞感知的分子信號(hào)通路。我們現(xiàn)在所使用的細(xì)胞低氧模型很多都是基于拉特克利夫教授的實(shí)驗(yàn)室建立的。

凱林于1957年出生在紐約。1982年他在杜克大學(xué)獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位。他在約翰霍普金斯大學(xué)和達(dá)納-法伯癌癥研究所接受內(nèi)科和腫瘤學(xué)專業(yè)培訓(xùn)，并在大衛(wèi)·利文斯頓(David Livingston)教授的實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究。在那里他開(kāi)始研究抑癌蛋白。值得一提的是，大衛(wèi)·利文斯頓教授可以說(shuō)在凱林的科研生涯中起到?jīng)Q定性作用，讓一度想要放棄科研的凱林找到希望。1992年，凱林在達(dá)納-法伯癌癥研究所建立了自己的實(shí)驗(yàn)室，并于2002年成為哈佛醫(yī)學(xué)院的教授。2010年，凱林當(dāng)選美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院士。

1 細(xì)胞氧感知機(jī)制

1774年卡爾·威爾海姆·舍勒(Carl Wilhelm Scheele)和約瑟夫·普里斯特利(J. Joseph Priestley)發(fā)現(xiàn)了氧氣的存在，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，我們對(duì)氧氣的認(rèn)知也從宏觀到微觀不斷地發(fā)展。氧氣關(guān)系到人類和動(dòng)物的生死存亡，是許多生化反應(yīng)不可或缺的物質(zhì)。它參與氧化磷酸化過(guò)程，從而為真核細(xì)胞的生物化學(xué)反應(yīng)提供動(dòng)力。大氣中的氧氣過(guò)多或過(guò)少都會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生重要影響，這也是進(jìn)化出復(fù)雜多細(xì)胞生物的原因之一。生物機(jī)體為適應(yīng)現(xiàn)有的氧氣含量，進(jìn)化出如心臟、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)等。氧氣向組織運(yùn)輸需要這些特殊的組織器官才能遞送至細(xì)胞內(nèi)。機(jī)體需要充足的氧氣供應(yīng)，又要避免由于氧氣過(guò)量而產(chǎn)生的氧中毒。為此，生物必須能夠感知氧氣并通過(guò)改變特定基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)氧氣水平的變化。關(guān)于氧氣與人體的互動(dòng)機(jī)制，具有里程碑意義的發(fā)現(xiàn)還要追溯到1938年科奈爾·海門斯(Corneille Heymans)對(duì)機(jī)體氧感知的探索。他發(fā)現(xiàn)血液中的氧氣對(duì)頸動(dòng)脈體產(chǎn)生刺激作用，通過(guò)大腦接收并傳導(dǎo)信號(hào)，控制呼吸頻率。此發(fā)現(xiàn)一舉斬獲當(dāng)年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。細(xì)胞如何感知氧氣水平，維持氧穩(wěn)態(tài)及氧平衡？這方面的分子機(jī)制一直是未解謎團(tuán)，而2019年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的三個(gè)獲得者向我們展示了細(xì)胞適應(yīng)氧氣濃度變化的分子機(jī)制。

1.1 故事的開(kāi)端：促紅細(xì)胞生成素(EPO)

這個(gè)故事始于對(duì)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的研究。EPO是調(diào)控紅細(xì)胞生成并決定血液攜氧能力的激素。當(dāng)機(jī)體感知到血液攜氧能力下降(貧血)或環(huán)境氧濃度降低(低氧)，腎臟和肝臟中特定細(xì)胞開(kāi)始分泌EPO，刺激骨髓內(nèi)紅系定向干細(xì)胞分化，產(chǎn)生更多的紅細(xì)胞應(yīng)對(duì)乏氧狀態(tài)，以增加氧氣的運(yùn)輸。研究EPO基因的調(diào)控可闡明維持氧穩(wěn)態(tài)所需的細(xì)胞乃至全身生理反應(yīng)的分子機(jī)制。最初的細(xì)胞氧感知和氧穩(wěn)態(tài)調(diào)控研究正是基于此而開(kāi)展的。

20世紀(jì)90年代，塞門扎對(duì)EPO調(diào)節(jié)的分子機(jī)制產(chǎn)生濃厚的興趣。1991年，塞門扎就確定EPO基因3'區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄激活響應(yīng)低氧所需的DNA序列[1]。這段特殊的DNA序列可以增強(qiáng)低氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，并直接關(guān)系到肝臟或腎臟的貧血或低氧。同年，拉特克利夫也在尋找細(xì)胞與氧氣是通過(guò)什么方式進(jìn)行互動(dòng)的。塞門扎研究團(tuán)隊(duì)基于對(duì)慢性腎衰竭模型中EPO mRNA的研究發(fā)現(xiàn)，處于低氧狀態(tài)的EPO mRNA含量會(huì)增加[2]，這揭示了EPO基因的調(diào)節(jié)存在氧依賴性。

那么，究竟是什么物質(zhì)控制著EPO基因的調(diào)節(jié)，還可隨著氧氣濃度的變化而變化呢？接下來(lái)，就是要找到開(kāi)啟細(xì)胞與氧氣互動(dòng)機(jī)制大門的那把“神秘鑰匙”。

1.2 神秘鑰匙：低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)

1992年，塞門扎在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物以一種氧依賴性的方式與已鑒定的DNA片段結(jié)合。這個(gè)復(fù)合物被命名為低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)。隨后，塞門扎開(kāi)始對(duì)HIF-1與EPO DNA的結(jié)合能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在有氧氣參與的條件下細(xì)胞中HIF-1與EPO DNA結(jié)合能力下降，而在低氧模型中其結(jié)合活性增強(qiáng)。當(dāng)?shù)脱跫?xì)胞增加氧氣濃度時(shí)，HIF-1結(jié)合EPO DNA的能力又會(huì)減弱，并且HIF-1可與EPO大溝中的DNA發(fā)生特異性結(jié)合[3]。1993年，拉特克利夫發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中普遍存在類似于EPO機(jī)制的氧感知系統(tǒng)，并且該系統(tǒng)介導(dǎo)對(duì)低氧的適應(yīng)性[4]。同年，塞門扎發(fā)現(xiàn)許多不產(chǎn)生EPO的細(xì)胞(包括皮膚、肺、卵巢和血管等來(lái)源的細(xì)胞)中普遍存在HIF-1及其基因序列，這些細(xì)胞對(duì)低氧都有反應(yīng)[5-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示應(yīng)對(duì)低氧反應(yīng)，需要HIF-1參與。兩個(gè)團(tuán)隊(duì)都發(fā)現(xiàn)氧感知機(jī)制并非只產(chǎn)生于EPO基因表達(dá)的腎和肝細(xì)胞中，這很可能是機(jī)體普遍存在的現(xiàn)象，那么HIF-1就是揭開(kāi)細(xì)胞與氧氣互動(dòng)的關(guān)鍵。

隨后，拉特克利夫在1994年建立的低氧模型中發(fā)現(xiàn)，HIF-1可直接調(diào)控甘油酸激酶(PGK)和乳酸脫氫酶(LDHA)的表達(dá)，這表明HIF-1也參與細(xì)胞能量代謝過(guò)程[7]。HIF-1不僅參與低氧狀態(tài)的調(diào)控，在低氧信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄中具有重要作用，還與糖酵解有關(guān)。這為HIF-1在腫瘤代謝通路中的核心位置奠定了基礎(chǔ)。塞門扎為了弄清楚HIF-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)，付出了巨大的努力。1995年1月，HIF-1首次被分離和純化。HIF-1是由120 kDa的HIF-1α和91～94 kDa的HIF-1β亞基(ARNT)組成，并確認(rèn)以異二聚體形式存在[8]。同年6月，HIF-1α和HIF-1β的蛋白結(jié)構(gòu)域也被確定下來(lái)[9]。并且，研究人員發(fā)現(xiàn)調(diào)控HIF-1α活性的分子機(jī)制以及HIF-1α在哺乳動(dòng)物細(xì)胞O2穩(wěn)態(tài)中的重要作用。1996—1998年間，塞門扎教授還發(fā)現(xiàn)HIF-1α是調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的核心因子。HIF-1α在胚胎發(fā)育、血管生成方面同樣起著至關(guān)重要的作用[10-11]。如果HIF-1α的基因遭到損害就無(wú)法誘導(dǎo)新生血管生成，氧感知系統(tǒng)也被破壞，可導(dǎo)致胚胎致死。那么，HIF-1α分子是如何感知氧氣的呢？

1.3 神來(lái)之筆：VHL蛋白

揭示HIF-1α分子是如何工作的，凱林起到了重要的推動(dòng)作用。1992年，凱林正在研究常染色體顯性遺傳性癌癥易感性疾病——希佩爾-林道(von Hippel-Lindau，VHL)綜合征。VHL抑癌基因的突變是導(dǎo)致這種疾病的罪魁禍?zhǔn)?，可?dǎo)致一系列的綜合征。VHL看起來(lái)與HIF-1α似乎并沒(méi)有什么直接聯(lián)系，但VHL基因突變可使其編碼的蛋白功能喪失，導(dǎo)致VEGF mRNA異常高表達(dá)。HIF-1α是調(diào)節(jié)VEGF的核心因子，這暗示兩者可能存在某種聯(lián)系。1995年，凱林研究發(fā)現(xiàn)VHL可與Elongin B、Elongin C、Cullin 2和Rbx1形成一種復(fù)合物，可選擇性地識(shí)別泛素連接酶E3，而VHL復(fù)合物與泛素化蛋白酶體系統(tǒng)有重要聯(lián)系，在氧氣存在條件下起到降解HIF蛋白的作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證VHL與HIF的關(guān)系，凱林于1996年發(fā)現(xiàn)VHL基因突變的腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)低氧誘導(dǎo)基因，導(dǎo)致VEGF/VPS、Glut-1和血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈的mRNA高表達(dá)。如果VHL基因重新引入腫瘤細(xì)胞，異常表達(dá)的VEGF/VPS、Glut-1和血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈的mRNA又會(huì)恢復(fù)至正常水平[12]。這表明VHL蛋白在氧氣水平變化產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。1999年，拉特克利夫發(fā)表的論文將VHL與HIF-1α更緊密地聯(lián)系在一起[13]。在該研究中，正常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了VHL/HIF-1復(fù)合物的生成，并靶向破壞HIF-1α亞基，導(dǎo)致HIF-1α迅速降解。而在低氧狀態(tài)下，VHL與HIF-1α也形成復(fù)合物，但其降解過(guò)程受到抑制。VHL基因突變或缺失的腫瘤細(xì)胞，HIF-1α蛋白穩(wěn)定性會(huì)顯著增強(qiáng)，從而增加腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。這進(jìn)一步證明了VHL對(duì)降解HIF-1α的關(guān)鍵作用。

1.4 揭開(kāi)謎底：脯氨酰羥基化

最關(guān)鍵和核心的問(wèn)題就是去揭示氧氣是以何種形式參與到VHL/HIF-1α的降解過(guò)程中的。事實(shí)上，Otto Warburg(1931年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主)很早就提出氧氣參與細(xì)胞的生化反應(yīng)需要酶的參與。VHL降解HIF-1是否也需要有特定酶的參與？如果HIF-1的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性受細(xì)胞中氧氣的精準(zhǔn)調(diào)控，那么HIF-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)的一個(gè)特定部位可能是感知氧的關(guān)鍵。2001年，兩篇揭示細(xì)胞感知氧氣機(jī)制的論文幾乎同時(shí)發(fā)表。凱林和拉特克利夫都詳細(xì)闡述了HIF-1α基因的激活存在氧依賴性，并且確定了使HIF-1α發(fā)生羥化反應(yīng)所需的酶——脯氨酰羥化酶。至此細(xì)胞氧感知的分子機(jī)制首次浮現(xiàn)在世人面前(圖2)[14-15]：有氧氣參與的條件下，HIF不穩(wěn)定的α亞基的脯氨酸殘基在脯氨酰羥化酶作用下，發(fā)生脯氨酰羥基化。VHL蛋白與泛素連接酶E3結(jié)合會(huì)形成包含VHL、Elongin B、Elongin C、Rbx1和Cullin-2的復(fù)合物。該復(fù)合物可被脯氨酰羥基化的HIF-1α識(shí)別并以共價(jià)結(jié)合，從而通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑將HIF-1α迅速降解。而在低氧狀態(tài)下，細(xì)胞核內(nèi)聚積了大量的HIF-1α并與β亞基二聚化，綁定到低氧調(diào)節(jié)基因，募集共激活因子并激活具有低氧反應(yīng)元件(HRE)的基因轉(zhuǎn)錄。HIF-1α和HIF-1β的穩(wěn)定表達(dá)可激活EPO以及VEGF基因，以起到增加毛細(xì)血管和紅細(xì)胞數(shù)量的作用來(lái)應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境。

圖2 細(xì)胞氧氣感知機(jī)制示意圖

2 HIF-1: 在多種疾病防治中的作用

了解細(xì)胞氧感知系統(tǒng)的運(yùn)作方式對(duì)防治多種疾病都具有重要意義。作為氧感知通路中的核心蛋白，HIF-1直接調(diào)節(jié)人體對(duì)缺氧狀態(tài)的反應(yīng)。靶向HIF-1蛋白的藥物有望治療貧血、癌癥等多種疾病。

2.1 貧血

許多疾病，包括貧血、心肌梗塞和中風(fēng)都與組織低氧有關(guān)。貧血疾病誘發(fā)的原因之一就是紅細(xì)胞含量減少，沒(méi)有足夠的氧氣供應(yīng)給各個(gè)組織器官。當(dāng)處于氧氣含量不足的環(huán)境時(shí)，提高HIF-1蛋白的表達(dá)，可增加紅細(xì)胞的數(shù)量及鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。HIF-1直接參與并調(diào)控EPO表達(dá)，是EPO的編碼基因，同時(shí)也是感知氧氣的核心因子，介導(dǎo)對(duì)低氧狀態(tài)的反應(yīng)。所以，抑制HIF-1的藥物較傳統(tǒng)的EPO類藥物更具潛力，適用范圍更廣。低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑(HIF-PHI)就是基于細(xì)胞氧感知原理開(kāi)發(fā)出來(lái)的藥物。HIF-PHI可抑制脯氨酰羥化酶，穩(wěn)定HIF-1蛋白表達(dá)，從而起到緩解貧血的作用?；诖?，F(xiàn)ibrogen公司公布了全球首個(gè)小分子HIF-PHI類治療腎性貧血的藥物“羅沙司他”，該藥物已于2018年12月在中國(guó)獲批上市。此外，細(xì)胞氧感知機(jī)制還可應(yīng)用于多種缺血低氧相關(guān)疾病的治療，包括眼底病、缺血低氧損傷、感染、傷口愈合及修復(fù)、炎癥、器官組織移植或再生、外周動(dòng)脈病、動(dòng)脈粥樣硬化等。

2.2 惡性腫瘤

揭示細(xì)胞氧氣感知的機(jī)制對(duì)惡性腫瘤的治療具有更深遠(yuǎn)的影響。惡性實(shí)體腫瘤往往因?yàn)檠芟到y(tǒng)的異常，導(dǎo)致血液中氧氣和營(yíng)養(yǎng)的缺乏，腫瘤微環(huán)境長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)。低氧會(huì)導(dǎo)致HIF-1α大量累積，研究表明，多種腫瘤類型都發(fā)現(xiàn)HIF-1α的高表達(dá)。HIF-1α還是“Warburg效應(yīng)”信號(hào)通路中的核心因子，并參與腫瘤新生血管的生成、生長(zhǎng)能量的供應(yīng)。此外，腫瘤細(xì)胞中HIF依賴的代謝重編程控制著腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的命運(yùn)。低氧在腫瘤細(xì)胞的諸多生化反應(yīng)過(guò)程，如氨基酸代謝、脂質(zhì)合成、脂肪酸氧化、pH的調(diào)節(jié)、多藥耐藥的發(fā)生、腫瘤微環(huán)境及免疫微環(huán)境中都起著關(guān)鍵作用[16]。圖3為HIF-1α信號(hào)通路示意圖。

圖3 HIF-1α信號(hào)通路示意圖

干預(yù)HIF-1α基因的表達(dá)，可影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。開(kāi)發(fā)HIF-1α抑制劑就是為了調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)性，達(dá)到“餓死”腫瘤細(xì)胞的目的。許多化合物可間接下調(diào)HIF-1α，包括mTOR抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HSP90抑制劑等。HSP90抑制劑，例如17-AAG，可在低氧細(xì)胞，甚至在VHL基因突變的腎癌細(xì)胞中誘導(dǎo)HIF-1α降解。第二代HSP90抑制劑ganetespib可抑制原位乳腺癌模型中的原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤侵襲和肺轉(zhuǎn)移。另一類蛋白酶體抑制劑，硼替佐米也可選擇性地抑制HIF-1α蛋白活性。硼替佐米通過(guò)靶向HIF-1α的C末端反式激活域來(lái)阻斷HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，是美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的治療多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的藥物。這些都是細(xì)胞氧感知機(jī)制所帶來(lái)的實(shí)際應(yīng)用。當(dāng)然，靶向HIF-1通路的治療還有很多問(wèn)題需要解決，如：HIF-1核心因子的亞型在腫瘤治療方面分別承擔(dān)什么樣的角色尚不清楚；有些HIF-1抑制劑治療效果不佳并且其毒副作用較大，需要更為精準(zhǔn)地分析不同HIF-1亞型對(duì)腫瘤進(jìn)展的各個(gè)方面(增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移)的影響，以指導(dǎo)最優(yōu)的治療策略。

綜上所述，從宏觀氧氣的發(fā)現(xiàn)到微觀的細(xì)胞對(duì)氧氣適應(yīng)性的調(diào)節(jié)，人們走過(guò)了兩個(gè)多世紀(jì)。三位獨(dú)立的科學(xué)家因?yàn)閷?duì)氧感知機(jī)制的原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)而聯(lián)系在一起?？茖W(xué)是機(jī)遇，更是挑戰(zhàn)，是一代又一代科學(xué)家們永不言棄的精神和披荊斬棘的決心，給患者以生的希望。認(rèn)知細(xì)胞的氧感知機(jī)制翻開(kāi)了揭示生命奧秘的偉大篇章，它幫助人們找到了治療包括貧血、癌癥等疾病的新方向。國(guó)內(nèi)外多家科研團(tuán)隊(duì)和制藥公司都已將精力投入到能夠激活或阻斷氧感知通路的新型靶向藥物。相信在不久的未來(lái)，隨著該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，會(huì)有越來(lái)越多的新型靶向藥物應(yīng)用于臨床。感謝三位科學(xué)家在細(xì)胞氧感知機(jī)制方面的探索和發(fā)現(xiàn)，這必將是生命科學(xué)史上濃重的一筆。