一氧化氮信號途徑參與草地早熟禾耐鎘機制的研究

鮮靖蘋，王勇，馬暉玲*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070； 2. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng) 453000)

草地早熟禾(Poapratensis)是多年生禾本科(Gramineae)草本植物，在我國北方被廣泛用于草坪建植，具有生物量大、適應(yīng)性強、根系發(fā)達等特點，可以迅速覆蓋地表，防止重金屬通過水或風(fēng)的侵蝕遷移到別處。我們在之前的研究中發(fā)現(xiàn)草地早熟禾可吸收重金屬Cd[33]，因此，將早熟禾作修復(fù)材料對Cd污染土壤修復(fù)具有潛在價值[34]。在眾多報道中，關(guān)于植物信號NO在草地早熟禾Cd脅迫方面的研究尚未見報道。本文初步探究內(nèi)源NO對草地早熟禾Cd脅迫生理響應(yīng)機制，以期為草地早熟禾修復(fù)重金屬污染土壤提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

采用由北京克勞沃草業(yè)技術(shù)開發(fā)中心提供的草地早熟禾‘午夜’(Poapratensis‘Midnight’)作為試驗材料。分析純CdCl2·2.5H2O購于上海中秦化學(xué)試劑有限公司；L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)、4-羧基苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)、鎢酸鈉(Tungstate)均購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計與處理

選取顆粒飽滿、大小一致的草地早熟禾種子若干，蒸餾水過夜浸泡后多次沖洗直至無癟種子漂浮在水面上，70%酒精浸泡沖洗后的種子1 min，20%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，滅菌水沖洗5～6次，置于濾紙上晾干，均勻撒播至以蛭石為基床、直徑8 cm、高10 cm的塑料育苗缽中，置于人工智能氣候培養(yǎng)箱，每天噴施蒸餾水保持充足水分，晝夜溫度為25℃/20℃，光周期循環(huán)16/8 h，幼苗展開3～4片葉后間苗至每缽30株均勻分布，移入盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的培養(yǎng)盒中，每3 d更換1次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液培養(yǎng)14 d后施加處理，設(shè)置5個處理(見表1)，處理時間7 d，采葉片測定各項指標(biāo)，處理重復(fù)3次。

植物中研究最多的兩個NO的酶源是一氧化氮合酶(NOS)類型的酶和硝酸還原酶(NR)[35]。NOS催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸和NO；L-精氨酸類似物L(fēng)-NAME已被廣泛用于抑制植物中的NOS活性[36]。NR是一種含鉬的酶，除了具有由硝酸鹽生成亞硝酸鹽的活性外，還通過亞硝酸鹽還原催化NO的形成。鎢酸鹽是一種鉬酸鹽類似物，在體內(nèi)抑制活性NR的形成[37]，也被證明可以阻斷NR依賴的NO生成[38]。cPTIO作為NO清除劑已被證明可提供一個氧原子結(jié)合NO生成NO2，同時cPTIO也可清除NO2，因此，產(chǎn)生的NO2被剩余的cPTIO清除[39]。

表1 試驗處理Table 1 Test treatment

1.3 測定指標(biāo)

APX活性：參考陳建勛的方法[40]。0.20 g草地早熟禾葉片在1.60 mL磷酸緩沖液(pH=7.80)中冰浴研磨，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃,12 000 g下離心20 min，取上清液0.10 mL上清液，加入1.70 mL含0.10 mmol·L-1EDTA-Na2的PBS(0.05 mol·L-1，pH=7)，再加入0.10 mL 5 mmol·L-1的AsA，最后加入0.10 mL 20 mmol·L-1H2O2，立即在20℃下測定OD290值在40 s內(nèi)的變化，計算單位時間內(nèi)AsA減少量和酶活性(室溫下測定，以不加H2O2為空白對照調(diào)零)。以1 min內(nèi)A290變0.01定義為一個酶活性單位U，酶活性以U·g-1(FW)表示

APX活性(U·g-1)= △A290×VT/(0.01VS×t×W)

△A290表示在290 nm處吸光值的變化；VT：提取液總體積(mL)；VS：酶液的體積(mL)；W：葉片的鮮重(g)；t：反應(yīng)時間(s)

SOD活性：采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定[41]。0.20 g草地早熟禾葉片在1.60 mL磷酸緩沖液(pH=7.80)中冰浴研磨，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000 g下離心20 min，取上清液40 μL，加入含3 mL反應(yīng)混合液的反應(yīng)管，同時做2支對照管，其中1支試管加3 mL反應(yīng)混合液和40 μL PBS(不加酶液)作為最大光還原管，另1支加3 mL反應(yīng)混合液和40 μL PBS同時遮光用于測定時調(diào)零。3 mL混合液由2.70 mL 14.50 mmol·L-1甲硫氨酸溶液、0.10 mL 3 mmoL·L-1EDTA-Na2溶液、0.10 mL 60 μmol·L-1核黃素溶液、0.10 mL 2.25 mmol·L-1NBT溶液組成，充分搖勻后4 000 Lux光照25℃下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對照管調(diào)零，分別測定各管在560 nm下的吸光度(OD560)，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活單位(U)。

SOD活性(U·g-1Fw)= [(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)

SOD活性以鮮重酶單位每克表示(U·g-1Fw)；Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積(mL)；Vt為測定時的酶液用量(mL)；W為樣品鮮重(g)。

POD活性：采用愈創(chuàng)木酚法測定[41]。0.20 g草地早熟禾葉片在1.60 mL磷酸緩沖液(pH=7.80)中冰浴研磨，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12 000 g下離心20 min，取上清液40 μL，加入含3 mL反應(yīng)混合液的反應(yīng)管，測定470 nm下的吸光度(OD470)值在40 s內(nèi)的變化。以PBS (pH=6，0.20 mol·L-1)代替酶液為對照調(diào)零。反應(yīng)混合液：取50 mL PBS(pH=6，0.20 mol·L-1)緩沖液于燒杯中，加入28 μL愈創(chuàng)木酚(2-甲氧基酚)于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至溶解愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后加入19 μL 30% H2O2。以每分鐘吸光度值變化(升高)0.01為1個酶活性單位(U)。

POD活性(U·g-1FW)=(ΔA470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)

ΔA470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積(mL)；Vs為測定時取用酶液的體積(mL)。

CAT活性：采用過氧化氫還原法測定[41]。0.20 g草地早熟禾葉片在1.60 mL磷酸緩沖液(pH=7.80)中冰浴研磨，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12 000 g下離心20 min。

反應(yīng)混合液的配制：取100 mL PBS(0.15 mol·L-1，pH=7)，加入0.15 mL 30% 的H2O2搖勻即可。取2.90 mL反應(yīng)液加入0.10 mL酶液，以PBS為對照調(diào)零，測定OD240值在40 s內(nèi)的變化。以每min OD值減少0.01為1個酶活性單位(U)。

CAT活性(U·g-1FW)=[ΔA240×Vt]/(W×Vs×0.01×t)

ΔA240：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；Vt為提取酶液總體積(mL)；Vs為測定時取用酶液體積(mL)。

葉綠素含量：0.20 g草地早熟禾葉片置于8 mL 95%無水乙醇溶液中浸泡24 h，測定450 nm，649 nm，665 nm波長下的吸光度。

Ca=13.95 A665-6.88 A649

Cb=24.96 A649-7.32 A665

Cx.c=(1000 A470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245

Ca+b=6.1 A665+20.04 A649

式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度(mg·L-1)；Cx.c為類胡蘿卜素的總濃度(mg·L-1)。

相對含水量：0.20 g左右草地早熟禾葉片稱鮮重(Fw)，置于蒸餾水中遮光浸泡5～8 h，濾紙吸干表面水分，稱量其飽水重(Tw)，放入烘箱100℃殺青15 min，70℃烘至恒重，稱干重(Dw)，計算相對含水量：RWC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)

MDA含量：采用TBA(硫代巴比妥酸)顯色測定[40]。稱取植物葉片0.20 g，加入2 mL 10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid，TCA)和少量石英砂，研磨至勻漿，然后加入8 mL 10%三氯乙酸進一步研磨，定容，4 000 r·min-1離心10 min，吸取2 mL上清液于10 mL具塞玻璃試管中，加入2 mL 0.6% 硫代巴比妥酸溶液，搖勻后沸水浴反應(yīng)10 min，取出試管迅速冷卻，4000 r·min-1離心10 min，取上清液，分別于532，450和600 nm處測定吸光度，按照公式計算MDA含量(μmol·g-1FW)：

CMDA(μmol·L-1)=6.45(A532-A600)—0.56A450

MDA含量= CMDA×提取液的量(mL)/植物組織鮮重(g)

Pro含量：采用酸性茚三酮顯色法測定[41]。稱取葉片0.20 g，剪碎置于試管中，向試管中加入5 mL 3%磺基水楊酸，沸水浴中加熱10 min(不斷搖動)，冷卻后過濾至干凈試管中(濾液為提取液)。吸取2 mL提取液、2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮于具塞玻璃試管中，沸水浴反應(yīng)40 min，冷卻后向試管中加入5 mL甲苯，充分振蕩，靜置分層后，在520 nm處比色(以甲苯為對照)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照公式計算Pro含量(μg·g-1FW)：

Pro含量=X×提取液總體積(mL)/(樣品鮮重×測定時提取液體積(mL))

式中，X為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得Pro含量(μg)。

干物質(zhì)含量：20株長勢一致草地早熟禾幼苗稱量葉片及根系鮮重(Fw)后置于烘箱60℃烘4 h，升溫至105℃烘至恒重，稱量絕對干重(Dw)。干物質(zhì)含量=Dw/Fw×100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Spss 19.0分析處理數(shù)據(jù)，Excel 2016作圖，Duncan法進行多重比較，本研究數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

圖1顯示，Cd處理及NO清除劑和合成抑制劑處理均不同程度增加了草地早熟禾SOD酶活性，添加NOS抑制劑、NO清除劑處理SOD活性分別比Cd脅迫升高了18.92%，25.80% (P<0.05)，分別比對照增加了36.93%，44.85%(P<0.05)，NR抑制劑處理則與CK差異不顯著(P>0.05)。

圖1 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片SOD活性的影響Fig.1 Effect of endogenous NO on SOD activity in leavesof Poa pratensis seedlings under cadmium stress

圖2 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片POD活性的影響Fig.2 Effect of endogenous NO on POD activity in leaves of Poa pratensis seedlings under cadmium stress

圖2顯示，單一Cd脅迫對POD活性影響最大，比CK增加79.22%(P<0.05)。NOS抑制劑、NR抑制劑處理POD活性分別比CK升高56.93%，59.34%(P<0.05)。然而，相對于單一Cd脅迫，添加NO清除劑后POD活性降低27.39%(P<0.05)。因此，可得出抑制內(nèi)源NO產(chǎn)生可導(dǎo)致草地早熟禾POD活性降低。

圖3 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片CAT活性的影響Fig.3 Effect of endogenous NO on CAT activity in leavesof Poa pratensis seedlings under cadmium stress

Cd脅迫會降低草地早熟禾幼苗葉片CAT活性(圖3)。1000 μmol·L-1Cd處理CAT活性比CK降低37.84%(P<0.05)。添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑后CAT活性分別增加12.56%，45.41%，52.66%；NR抑制劑、NO清除劑處理CAT活性顯著高于NOS抑制劑處理與Cd處理(P<0.05)。NO清除劑處理下CAT增幅最大，其次是添加NR抑制劑處理，因此，可得出抑制內(nèi)源NO可不同程度增加CAT活性。

圖4 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片APX活性的影響Fig.4 Effect of endogenous NO on APX activity in leavesof Poa pratensis seedlings under cadmium stress

Cd處理草地早熟禾幼苗葉片APX活性比CK降低20.45%(圖4，P<0.05)。添加NOS抑制劑、NO清除劑后APX活性分別比Cd處理升高15.65%，19.85%(P<0.05)。Cd處理降低草地早熟禾APX活性，減少內(nèi)源NO可增加APX活性，且添加NOS抑制劑和NO清除劑增幅最大。

2.2 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片光合特性的影響

表1顯示，Cd脅迫可降低草地早熟禾幼苗葉片色素含量，1000 μmol·L-1Cd脅迫下葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著降低，Cd脅迫下添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑處理可不同程度增加葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量。Cd處理與CK相比，葉綠素a/b的值增加，但差異不顯著(P>0.05)。Cd脅迫下添加NOS抑制劑及NO清除劑均顯著降低葉綠素a/b的值(P<0.05)，因此，添加NO清除劑及合成抑制劑可較大程度草地早熟禾光合色素含量，且根據(jù)葉綠素a/b的值發(fā)現(xiàn)抑制NOS途徑及添加NO清除劑對草地早熟禾產(chǎn)生影響較大。

表1 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片光合特性的影響Table 1 Effects of endogenous NO on photosynthetic characteristics in leaves of Poa pratensis seedlings under cadmium stress

2.3內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片MDA含量的影響

Cd脅迫處理可增加MDA含量(圖5)。添加NOS抑制劑、NO清除劑后MDA含量分別比Cd處理MDA含量增加87.19%，93.19%(P<0.05)。因此，Cd脅迫可導(dǎo)致草地早熟禾質(zhì)膜損傷，Cd脅迫添加NOS抑制劑和NO清除劑可顯著加劇質(zhì)膜損傷，而添加NR抑制劑則影響程度較小，表明NOS途徑在緩解氧化脅迫方面作用強于NR途徑，且NO的產(chǎn)生對早熟禾減輕膜質(zhì)損傷具有重要作用。

圖5 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片MDA含量的影響Fig.5 Effect of endogenous NO on MDA content inleaves of Poa pratensis seedlings under cadmium stress

2.4 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片Pro含量的影響

圖6顯示，Cd脅迫下Pro含量顯著增加(P<0.05)，添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑分別比Cd處理Pro含量降低38.79%，63.39%，36.30%(P<0.05)。分析發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下添加NO合成抑制劑及清除劑可顯著影響草地早熟禾Pro含量且添加NR抑制劑影響程度最大，因此，內(nèi)源NO對Cd脅迫下早熟禾體內(nèi)Pro合成具有重要意義。

圖6 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片Pro含量的影響Fig.6 Effect of endogenous NO on Proline content in leavesof Poa pratensis seedlings under cadmium stress

2.5 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗生長的影響

圖7顯示，Cd脅迫處理顯著影響草地早熟禾相對含水量(P<0.05)，添加NOS抑制劑、NO清除劑處理相對含水量比Cd處理相對含水量分別降低15.73%，27.13%(P<0.05)，而添加NR抑制劑對相對含水量影響較小，因此，抑制NOS途徑及添加NO清除劑可加重草地早熟禾的毒害。

圖8顯示，Cd脅迫可降低草地早熟禾幼苗葉片干物質(zhì)量，添加NOS抑制劑、NO清除劑處理干物質(zhì)量分別比Cd處理干物質(zhì)量降低13.39%，11.51%(P<0.05)。添加NR抑制劑處理則降幅較小，因此，NO合成抑制劑與NO清除劑可不同程度降低草地早熟禾干物質(zhì)量，內(nèi)源NO在草地早熟禾抵御Cd毒害方面具有積極作用，且NOS途徑的貢獻大于NR途徑。

圖7 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片相對含水量的影響Fig.7 Effect of endogenous NO on relative water contentin leaves of Poa pratensis seedlings under cadmium stress

圖8 內(nèi)源NO對Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片干物質(zhì)量的影響Fig.8 Effect of endogenous NO on dry matter content in leaves of Poa pratensis seedlings under cadmium stress

2.6 Cd脅迫下NO合成抑制劑及清除劑對草地早熟禾幼苗葉片NO含量的影響

圖9顯示，Cd脅迫下草地早熟禾體內(nèi)NO含量增加，Cd脅迫下添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑可顯著降低NO含量，CK及Cd處理都具有較高內(nèi)源NO水平。NOS途徑產(chǎn)生較多NO而NR途徑則產(chǎn)生量較少。

圖9 NO合成抑制劑及清除劑對草地早熟禾幼苗葉片NO含量的影響Fig.9 Effect of NO synthesis inhibitors and scavengers on NO content in leaves of Poa pratensis seedlings

3 討論

非生物脅迫水平下添加L-NAME和Tungstate可分別抑制一氧化氮合成酶途徑、硝酸還原酶途徑產(chǎn)生NO，而添加cPTIO可有效清除植物體內(nèi)NO[42]。圖9顯示，添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑可顯著降低Cd脅迫下草地早熟禾幼苗葉片內(nèi)源NO含量(P<0.05)，其中NO清除劑cPTIO降低程度最大，而NR抑制劑Tungstate降低程度較小，NOS抑制劑L-NAME清除內(nèi)源NO作用效果優(yōu)于NR抑制劑Tungstate，因此，NOS途徑可能是草地早熟禾幼苗葉片產(chǎn)生內(nèi)源NO的主要途徑，一氧化氮合酶可能是合成內(nèi)源NO的關(guān)鍵酶。

植物在逆境脅迫下會產(chǎn)生ROS信號引發(fā)植物防御反應(yīng)，而酶類和非酶類抗氧化物質(zhì)組成的抗氧化系統(tǒng)則被激活來抵御氧化脅迫，酶類抗氧化劑則被認(rèn)為是最直接、最有效的途徑[43]。有研究指出，適宜濃度的外源NO可增加野生早熟禾的抗氧化酶活性[44]，并可通過提高抗氧化酶活性來緩解紫花苜蓿(Medicagosativa)PEG脅迫[45]、小麥(Triticumaestivum)銅脅迫[46]；這些研究結(jié)果與本文研究結(jié)果一致，本試驗中在鎘脅迫下，草地早熟禾通過提高SOD活性清除Cd脅迫產(chǎn)生的過量超氧自由基陰離子，減少內(nèi)源NO也可使SOD活性增加，這與劉柿良[5]研究結(jié)果一致；SOD清除ROS的同時產(chǎn)生大量H2O2，植物通過增強POD活性來代謝過量H2O2，所以導(dǎo)致草地早熟禾葉片POD活性增強，而NO可通過提高POD活性來增加植物抗逆性，清除

NO后POD活性降低，氧化脅迫加重；Cd離子占據(jù)了抗氧化酶活性中心，使這些酶失去原有功能，所以本試驗中草地早熟禾幼苗葉片的CAT和APX活性在Cd脅迫下表現(xiàn)出明顯下降；內(nèi)源NO的減少可使草地早熟禾幼苗葉片CAT和APX活性增加，這和牛奎舉[15]的研究結(jié)果一致，可能是因為SOD歧化反應(yīng)產(chǎn)生過量H2O2，提高幼苗葉片CAT和APX活性可清除過量的H2O2。

高濃度Cd脅迫導(dǎo)致植物葉片脫落，葉綠素含量降低，并抑制葉綠素的生物合成從而抑制光合作用[47]。高桂青等[49]指出，Cd脅迫可顯著降低馬來眼子菜(PotamogetonMalaianus)葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b的值；本研究結(jié)果與其一致，即Cd脅迫導(dǎo)致草地早熟禾幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量降低，其原因可能是Cd離子被植物吸收后可與巰基蛋白結(jié)合或取代Fe2+，Mg2+，Zn2+等[48]。吳旭紅等[50]研究發(fā)現(xiàn)外源NO可提高冷害脅迫下南瓜(Cucurbitamoschata)幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b的值，本試驗結(jié)果與其不同，本試驗中抑制內(nèi)源NO的產(chǎn)生促進了葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量增加，這可能是植物為抵抗外界脅迫而做出的反應(yīng)。本研究中，葉綠素a/b的值在添加Cd脅迫及添加Cd脅迫同時施加NR抑制劑后略有增加，表明輕度脅迫在一定程度上可增強植物抗逆性，而添加NOS抑制劑及NO清除劑后葉綠素a/b的值顯著降低(P<0.05)，表明內(nèi)源NO可影響草地早熟禾對重金屬Cd的耐受程度。

MDA是膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量可反映植物在脅迫條件下體內(nèi)膜質(zhì)過氧化的程度[15]。本試驗中，草地早熟禾幼苗葉片MDA含量在Cd脅迫下呈增加趨勢，這可能與Cd脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)膜質(zhì)過氧化有關(guān)，這與尚玉坤等[51]和古洪雙等[52]的研究結(jié)果一致；而同時我們發(fā)現(xiàn)，抑制草地早熟禾幼苗內(nèi)源NO的產(chǎn)生可導(dǎo)致MDA含量增加，說明內(nèi)源NO的減少使植株受到的氧化脅迫加重，結(jié)果表明，NO信號分子可通過降低MDA在草地早熟禾體內(nèi)的累積來緩解鎘脅迫引發(fā)的植株葉片氧化損傷，這與張倩等[53]和楊楊[54]的研究結(jié)果相似。

Pro在植物抵御Cd脅迫方面具有重要作用，大量研究指出Cd脅迫下植物體內(nèi)Pro含量顯著增加，例如關(guān)于狼尾草(Pennisetumalopecuroides)[55]、檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)[56]、小麥[57]等的研究，與這些結(jié)果類似，本研究中施加Cd脅迫后草地早熟禾葉片Pro大量累積，原因一方面可能是為了清除自由基，另一方面是為了促進植物螯合肽GSSG合成[5]。王芳等[58]指出Cd脅迫可降低玉米(Zeamays)植株體內(nèi)Pro含量，馬曉麗等[59]研究發(fā)現(xiàn)外源NO可降低Cd脅迫下小麥Pro的累積，本研究結(jié)果與其相似，試驗中減少內(nèi)源NO后植物Pro含量降低，可能是因為NO可通過調(diào)節(jié)纖維素含量來緩解Cd脅迫，或是清除NO或抑制NO產(chǎn)生后Cd離子進入細胞內(nèi)部對植物產(chǎn)生毒害或與Pro形成復(fù)合物，降低Pro含量[60]。

NO信號在植物生長方面也具有積極作用[61]，本研究中施加Cd脅迫后草地早熟禾幼苗葉片相對含水量及干物質(zhì)量降低，主要原因可能是Cd2+通過抑制草地早熟禾水孔蛋白基因表達而抑制植物對水分的吸收，降低植物相對含水量；其次，Cd2+可能通過影響植物細胞分裂及伸長來抑制植物生長。Cd脅迫水平下施加ROS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑均不同程度降低草地早熟禾幼苗葉片相對含水量及干物質(zhì)量，可能是因為清除NO后Cd脅迫毒害效應(yīng)加重，導(dǎo)致干物質(zhì)量及相對含水量降低。

4 結(jié)論

NO在植物生理及生長方面具有積極意義，添加NOS抑制劑、NR抑制劑、NO清除劑可顯著抑制草地早熟禾內(nèi)源NO的產(chǎn)生，NOS途徑可能是草地早熟禾內(nèi)源NO產(chǎn)生的主要途徑；Cd脅迫下內(nèi)源NO可通過調(diào)控草地早熟禾抗氧化酶活性來維持活性氧平衡，可通過降低MDA含量，增加Pro含量，增加光合色素含量，增加干物質(zhì)量、相對含水量以減輕Cd脅迫造成的生長抑制，增強植物抗逆性。