點籃子魚染色體核型分析

周劍光，王妤，王昱斌，張林，張濤，鄒雄，劉鑒毅

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（武漢），湖北 武漢 430223；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

點籃子魚（Siganus guttatus Bloch，1787）隸屬于鱸形目Perciformes、刺尾魚亞目Acanthuroidei、籃子魚科Siganidae、籃子魚屬Siganus，是一種雜食、廣鹽的暖水性魚類，主要分布于熱帶亞熱帶的印度西太平洋及我國南海海域[1]。我國對籃子魚的研究主要集中在形態(tài)特征[2-4]、攝食與生長[5]、人工繁殖[6]、肌肉營養(yǎng)成分分析[7]等方面。長鰭籃子魚S.canaliculatus、褐籃子魚S.fuscescens、爪哇籃子魚S.javus、蠕紋籃子魚S.vermiculatus、黑籃子魚S.spinus 的染色體組型已有報道[8-12]，而對點籃子魚染色體核型的研究尚未見報道。本文通過腹腔注射植物血球凝集素（PHA）和秋水仙素，取腎臟細(xì)胞空氣干燥制片，首次研究并報道了點籃子魚的染色體組型，以補充籃子魚科的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗魚

用于制備染色體的24 尾（9 雌15 雄）點籃子魚為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所瓊海研究中心人工繁殖的苗種，體質(zhì)量在100～200 g。實驗用魚于2018 年5 月9 日空運至中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所種質(zhì)實驗室，先用1%的人工海水在1.0m×0.6m×0.8m 的玻璃鋼盆中暫養(yǎng)一周，水溫控制在20～25℃，待實驗魚適應(yīng)環(huán)境后即開始實驗。

1.1.2 儀器與試劑

主要儀器與試劑包括Olympus IX 81 倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)（Olympus 公司，Japan）、植物血球凝集素（PHA，源葉生物公司）、秋水仙素（Urchem 公司）和吉姆薩（Giemsa）染色液（Solarbio 公司）等。

1.2 方法

1.2.1 染色體標(biāo)本制備

參考周劍光等[13]的方法并稍作修改：（1）注射PHA 和秋水仙素：向?qū)嶒烎~腹腔注射PHA，劑量為10～15μg·g-1（魚體質(zhì)量）；24h 后，腹腔注射秋水仙素，劑量為1.0～6.0μg·g-1（魚體質(zhì)量）；（2）制備細(xì)胞懸液，注射秋水仙素1.5～5.0h 后，剪開實驗魚的鰓部動脈放血20min，取出腎組織用0.85%生理鹽水洗滌3～4 次，將組織剪碎、過濾細(xì)胞懸液，再放入離心管中，以1 000r·min-1離心10min（以下同），得到沉淀的點籃子魚腎細(xì)胞；（3）低滲和固定，往離心管中的沉淀細(xì)胞加入6mL 的0.075mol·L-1的KCl 低滲液，低滲50～60min；隨后滴加0.5mL 預(yù)冷新配的卡諾氏固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1，以下同），預(yù)固定3～4min 后離心10min；量取4mL 固定液加入到剛棄去上清液的沉淀細(xì)胞中，用吸管吹打均勻，固定20min 后再離心10min；再重復(fù)固定2 次，每次20min；（4）滴片與染色，將細(xì)胞懸液滴于預(yù)冷載玻片上，并在酒精燈上過火2～3 次后放置通風(fēng)干燥處自然風(fēng)干；用15%吉姆薩（Giemsa）染色液將風(fēng)干的染色體玻片染色35min，用蒸餾水沖洗玻片，自然風(fēng)干后鏡檢。

1.2.2 染色體眾數(shù)確定及核型分析

參照TAN 等[14]方法稍加修改，方法如下：

（1）眾數(shù)確定

對24 尾（9 雌15 雄）點籃子魚的120 個分散良好、清晰的染色體中期細(xì)胞，用Olympus IX 81 倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照并統(tǒng)計染色體數(shù)目，根據(jù)眾數(shù)確定點籃子魚二倍體染色體數(shù)。

（2）核型分析

選取10 個數(shù)目完整、形態(tài)清晰、分散度良好、長度適中（正中期）、著絲點清楚、2 條染色單體適度分開的分裂相，用Photoshop CC 軟件分別測量每一條染色體的長臂和短臂，數(shù)據(jù)取平均值。計算其相對長度、臂比值和著絲粒指數(shù)，并按Levan 等[15]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對、分類并排列核型。染色體相對長度、臂比值和著絲粒指數(shù)的計算公式：染色體相對長度=（染色體長度/染色體組總長度）×100%；染色體臂比=長臂長度/短臂長度；著絲粒指數(shù)=（短臂長度/該染色體總長度）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素處理劑量、溫度與時間的效果

設(shè)計20℃、23℃和25℃下不同秋水仙素劑量及處理時間的8 組染色體標(biāo)本制備實驗。發(fā)現(xiàn)在20℃時，不同秋水仙素劑量及不同處理時間獲得的染色體分裂相均極少，當(dāng)劑量為4.0～6.0μg·g-1（魚體質(zhì)量），處理時間為5.0h，獲得的染色體呈短粗型，染色體臂收縮嚴(yán)重，著絲點位置不清晰；當(dāng)劑量為1.5～2.5μg·g-1（魚體質(zhì)量），處理時間為4.0h，獲得的染色體短粗型和狹長型均有，核型較好。溫度25℃時，當(dāng)秋水仙素劑量為2.0～2.5μg·g-1（魚體質(zhì)量），處理時間為3.0～4.0h，獲得的染色體分裂相多，但染色體形態(tài)多樣，短粗型較多，狹長型較少；當(dāng)劑量為1.0～1.5μg·g-1（魚體質(zhì)量），處理時間為2.5～3.0h，獲得的染色體分裂相多，染色體狹長型，sm 組（亞中部著絲點染色體，r（臂比）＝1.71～3.00）和st 組（亞端部著絲點染色體，r＝3.01～7.00）染色體長短臂清晰，著絲點位置易辨（表1）。

表1 不同溫度下秋水仙素注射量及處理時間染色體標(biāo)本的制備效果比較Tab.1 Comparison of preparation of chromosome specimen in golden rabbitfish,Siganus guttatus exposed to different injection volume and treatment periods of colchicine at different temperatures

2.2 點籃子魚染色體數(shù)目

對腎細(xì)胞空氣干燥制片法制備的24 尾（9 雌15 雄）點籃子魚染色體標(biāo)本進(jìn)行了顯微觀察并拍照，統(tǒng)計了120 染色體中期分裂相的數(shù)目，結(jié)果見表2。由表2 可知，染色體數(shù)目為48 的細(xì)胞數(shù)有87個，占72.50%，由此確定點籃子魚的染色體眾數(shù)為2n=48（圖1 A）。

2.3 點籃子魚的染色體核型

點籃子魚染色體的核型數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表3。按Levan 等[15]命名法，點籃子魚全部48 條染色體可分成3 組。9 號和14 號共2 對染色體r＝2.35～2.89范圍內(nèi)，屬亞中部著絲點染色體sm 組；1、2、3、5 和7 號共5 對染色體r＝3.70～4.53 范圍內(nèi)，屬亞端部著絲點染色體st 組；其余17 對染色體r＞7.0，屬端部著絲點染色體t 組。因此，點籃子魚的核型公式為2n＝4sm+10st+34t，臂數(shù)（NF）＝52。點籃子魚染色體相對長度最長為（5.91±0.20）%，而最短為（2.36±0.34）%。按相對長度排列，制成點籃子魚染色體核型圖（圖1B）。由圖1 B 可知，點籃子魚的5對st 組染色體相對較大，而2 對sm 組染色體相對較小。未發(fā)現(xiàn)帶有隨體、次縊痕的染色體和異形性染色體。

表2 點籃子魚二倍體染色體數(shù)目計數(shù)Tab.2 Counts of the diploid chromosome in golden rabbitfish,Siganus guttatus

表3 點籃子魚染色體核型數(shù)據(jù)Tab.3 The karyotypic data of chromosomes in golden rabbitfish,Siganus guttatus（n=10;x±SD）

圖1 點籃子魚染色體中期分裂相圖譜（A）及核型（B）Fig.1 The metaphase chromosome（A）and karyotype（B）in golden rabbitfish,Siganus guttatus

3 討論

染色體與核型分析對研究魚類遺傳和進(jìn)化具有重要意義。淡水魚類染色體核型的研究已有大量報道和專著出版[16]，但是海水魚類染色體核型的研究報道相對較少。截至2019 年，參考卓孝磊等[17]及作者本人的統(tǒng)計，中國已經(jīng)進(jìn)行染色體研究的海水魚類約有113 種（鱸形目82 種），分屬7 個目35科，約占我國近3100 種海水魚類的3.65%；染色體數(shù)目2n=48 的占多數(shù)，約87 種，占總數(shù)的77.0%。

趙金良[18]指出，海水魚類染色體形態(tài)以端部、亞端部著絲粒染色體較多，而中部、亞中部著絲粒染色體較少。目前已報道染色體核型的籃子魚共5種（表4），其中長鰭籃子魚S.canaliculatus、爪哇籃子魚S.javus 的染色體數(shù)目為48，核型公式為2n=48t（NF=48），均為端部染色體；褐籃子魚S.fuscescens、蠕紋籃子魚S.vermiculatus 的染色體數(shù)目也為48，核型公式為2n=2a+46t（NF=50），有1 對近端著絲粒染色體和23 對端部染色體；黑籃子魚S.spinus 的染色體數(shù)目為42，核型公式為2n=6m+36t（NF=48），有3 對中部染色體和18 對端部染色體;而本文報道的點籃子魚的染色體數(shù)為48，核型公式為2n=4sm+10st+34t（NF=52），有2 對亞中部染色體、5 對亞端部染色體和17 對端部染色體。除黑籃子魚的染色體數(shù)目為42 外，其余5 種籃子魚的染色體數(shù)目均為48，但核型公式和染色體臂數(shù)存在區(qū)別。楊慧一[19]的報道，秋水仙素濃度和處理時間兩種因素均可使染色體產(chǎn)生不同程度的收縮，導(dǎo)致研究結(jié)果偏差。由于制片方法不當(dāng)，sm 和st 型染色體有時著絲點不易區(qū)分，易與t 型染色體混淆。6 種籃子魚的染色體核型公式和染色體臂數(shù)存在區(qū)別的原因是否也與秋水仙素劑量和處理時間不同有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

表4 籃子魚科（鱸形目）中魚類的細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗。Tab.4 Cytogenetic reviews of fishes in family Siganidae（Perciformes）

小島吉雄[20]對800 余種已作核型研究的魚類染色體進(jìn)行研究，將真骨魚類劃分為低位類、中位類和高位類3 個演化類群。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：進(jìn)化上越處于上位，染色體越收斂，端著絲粒染色體多，臂數(shù)少，在魚類系統(tǒng)演化上屬高位類，染色體數(shù)在2n=42～48 的范圍內(nèi)，峰值是2n=48，m 型染色體（包括m 和sm 染色體）少，a 型染色體（包括st 和t染色體）多。點籃子魚的染色體數(shù)目為2n=48，核型公式為2n=4sm+10st+34t，m 型染色體數(shù)目為4，a 型染色體數(shù)目為44，NF=52，為典型的高位類群染色體數(shù)目。因此，點籃子魚在魚類系統(tǒng)演化上屬高位類群。

李樹深[21]研究發(fā)現(xiàn)，利用著絲粒染色體和臂數(shù)數(shù)目可以劃分不同魚類類群，具有較多的端部著絲粒染色體的魚類屬于原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的魚類則屬于特化類群，染色體臂數(shù)多的類群較之臂數(shù)少的類群更為特化。由表4 可知，點籃子魚的染色體臂數(shù)較其他籃子魚染色體臂數(shù)多，且具有較多亞中部著絲粒染色體，推測點籃子魚可能是籃子魚科中較晚分化出來的，在進(jìn)化上屬于較為特化的類群。