23份豌豆材料過氧化物酶同工酶研究

王翠玲， 楊曉明, 王旺田， 周衛(wèi)東

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所， 蘭州 730070， 3. 蘭州現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院 農(nóng)林分院， 蘭州 730070)

豌豆(PisumsativumL.)屬豆科，蝶型花亞科，一年生或越年生攀援性草本植物，兼有蔬菜、糧食、飼料功能，是世界第二大食用豆類作物，豌豆適應(yīng)能力很強(qiáng)，在全世界范圍內(nèi)有廣泛的地理分布，多樣化的生長條件形成了豌豆的遺傳多樣性[1]。豌豆還具有良好的固氮性能，能夠改善土壤氮肥供應(yīng)，在草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用[2-3]。世界各地區(qū)都十分重視對豌豆種質(zhì)資源的研究，對其種質(zhì)資源進(jìn)行收集、利用和保存[4]。中國地域廣闊，豌豆資源比較豐富，其收集和研究開始于20世紀(jì)60年代，目前國家種質(zhì)資源庫中已保存豌豆資源5000余份[5]。豌豆種質(zhì)資源的研究，可以豐富我國豌豆遺傳資源基因庫，提高豌豆抗逆性、抗病性研究，加快豌豆新品種培育的步伐[1，4，6]。

過氧化物酶(peroxidase, POD)是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。過氧化物酶同工酶酶譜的差異能夠反映基因所處的遺傳背景差異[7-9]。宋志文等[10]利用過氧化物酶同工酶研究中國東北地區(qū)野豌豆屬植物；張建全等[11]對4個(gè)春箭舌豌豆品系原種及第3代過氧化物酶同工酶分析，探討F3代農(nóng)藝性狀等發(fā)生變化的遺傳機(jī)制。本研究擬對23個(gè)豌豆種質(zhì)資源的過氧化物同工酶表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)合豌豆種子形態(tài)特征，為豌豆的遺傳多樣性分析以及新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

由甘肅省農(nóng)科院隨機(jī)抽取國內(nèi)外不同地理來源豌豆材料23份。中國品種資源20份，分別來自西藏(3份)、甘肅(2份)、陜西(5份)、四川(4份)、內(nèi)蒙古 (2份)、云南(1份)、臺灣(1份)、寧夏 (2份)；國外品種資源3份，來自澳大利亞(3份)。各材料編號特征見表1。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)培養(yǎng)及酶液的提取

23份豌豆材料各選取成熟飽滿的種子8～10粒浸泡，萌發(fā)，每天早晚各換MS營養(yǎng)液2次，14 d后，取各豌豆的根0.5 g洗凈，于預(yù)冷的研缽中，加入樣品提取液5 mL，研成勻漿，16 000 r/min離心10 min，取上清液，即酶液，備用。

1.2.2 酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳[12]

采用聚丙烯酰胺垂直平板電泳。濃縮膠T=3.5%，分離膠T=7.5%，電極緩沖液pH 8.3，將酶液與樣品處理液1∶1混合，每空加樣15 μL，起始電壓110 V，分離膠電壓200 V，電泳至溴酚藍(lán)下沿1 cm左右處停止。

1.2.3 過氧化物同工酶酶染色

電泳結(jié)束后，剝膠，采用醋酸聯(lián)苯胺法進(jìn)行染色，具體步驟為：將蒸餾水漂洗過的凝膠放入POD染色液中，震蕩5 min待酶帶顯出后，用蒸餾水漂洗，拍照繪圖分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)電泳照片，記錄數(shù)據(jù)，采用美國UVP凝膠成像分析系統(tǒng)求出相對遷移率，計(jì)算相似系數(shù)和不相似系數(shù)。酶帶的相對遷移率(Rf)=酶帶的遷移距離/溴酚藍(lán)的遷移距離；過氧化物酶同工酶酶譜間相似系數(shù)c=2w/(a+b)，其中c為酶譜間相似系數(shù)，w為A和B兩個(gè)種相同的酶帶數(shù)，a為種A在酶譜中的酶帶數(shù)，b為種B在酶譜中的酶帶數(shù)。采用SPSS23.0軟件對 23份豌豆材料的親緣關(guān)系及遺傳差異進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豌豆材料幼苗根部過氧化物酶酶譜特征

23份供試豌豆材料根部過氧化物酶同工酶酶譜和酶譜模式見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出：各豌豆材料過氧化物同工酶在酶帶數(shù)、酶量、相對遷移率等方面存在差異，有的位點(diǎn)上出現(xiàn)穩(wěn)定一致的酶帶，有的位點(diǎn)呈現(xiàn)很強(qiáng)的特異性。供試材料中共出現(xiàn)161條酶帶，酶帶類型為14種，酶帶最多是8條酶帶，最少是5條酶帶，有8條、7條酶帶的材料為多數(shù)，少數(shù)材料酶帶為6條或5條，表明23個(gè)供試豌豆材料具有較豐富的遺傳多樣性。

根據(jù)酶譜特征，從負(fù)極到正極按相對遷移率Rf可把它們分成3個(gè)區(qū)，即A、B、C 3個(gè)區(qū)域，A區(qū)是近陰極端的慢速遷移區(qū)，Rf=0.13～0.21，有3種類型酶帶，23個(gè)豌豆材料在A區(qū)共有酶帶P1，Rf=0.13。B區(qū)為中速遷移區(qū)，Rf=0.37～0.51，有4種類型酶帶，在B區(qū)，23號有1條酶帶，其余材料有2條酶帶；在B區(qū)的共有帶為P4，Rf=0.37。A區(qū)與B區(qū)各品種P1、P4的染色程度不一樣，說明不同材料的酶活性差異較大，酶帶染色最深為1、2、6、11、12、13、15及19號材料，而8、10、14號材料的染色最淺。C區(qū)為近陽極端的快速遷移區(qū)，Rf=0.62～0.83，有7種類型酶帶，不同材料的酶帶數(shù)有2到4條不等，C 區(qū)的沒有公共帶，C區(qū)的酶帶數(shù)、酶量在不同豌豆品種間有差異較大，在染色程度上表現(xiàn)非常明顯，但也一些比較接近，如12和13號材料。

表1 23份豌豆材料編號

圖1 23份豌豆材料豌豆幼苗根過氧化物酶同工酶電泳圖譜

Figure 1 The electrophoretogram of POD isozymes in the roots of 23 cultivars ofPisumsativumL.

2.2 不同豌豆材料過氧化物酶同工酶聚類分析

親緣關(guān)系分析聚類分析是用數(shù)學(xué)方法將一批樣品(變量)按其性質(zhì)的親疏遠(yuǎn)近程度進(jìn)行分類的科學(xué)方法，用酶譜間相似系數(shù)(similarity coefficient) 的大小表示分類群親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，酶譜相似系數(shù)等于2個(gè)分類群中相同的酶帶總數(shù)除以2個(gè)分類群中酶帶總數(shù)。相似系數(shù)在0～1之間，親緣關(guān)系越近的種類，相似系數(shù)越接近于1，彼此無關(guān)的種類，其相似系數(shù)越接近于0。利用各品種所具有的酶帶數(shù)計(jì)算出相似系數(shù)c，各個(gè)種源間的遺傳相似度在0.33～1.00之間，說明不同種源的豌豆種子間有不同程度的遺傳差異。

圖2 23份豌豆材料根過氧化物酶同工酶酶譜模式圖

采用SPSS23.0軟件對23份豌豆材料的親緣關(guān)系及遺傳差異進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)取不同閾值時(shí)聚成不同類，若取0.5時(shí)，供試豌豆材料可聚為5類，分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ。第Ⅰ類為1、2號材料，都來源于中國西藏，全國統(tǒng)一編號為G0004526和G0004548，品種名都為豌豆；粒形為球形，但種皮表面有差異，1號種皮凹坑，2號光滑。第Ⅱ類為3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17號材料，共14分材料，分別來源于中國甘肅(2份)、中國陜西(5份)、中國四川(3份)、中國內(nèi)蒙古 (2份)、中國云南(1份)、中國寧夏 (1份)。從品種來看，以麻豌豆居多，有 8個(gè)品種為麻豌豆，小麻豌豆、大麻豌豆、青麻豌豆、青豌豆各1份，2份豌豆。其中3號與17號材料、8號與16號材料、12號與13號材料親緣關(guān)系相互最近，相似系數(shù)為1。第Ⅲ類為18、19、20、21、23號材料，其中18為來自中國四川的白豌豆，全國統(tǒng)一編號是G0005571；19號為來自中國臺灣的臺中11(莢豌豆)；20號是來自中國寧夏的藍(lán)豆，粒形為扁形；21和23號都來自于澳大利亞。第Ⅳ類為22號材料，自于澳大利亞的品種JI.1089，單獨(dú)一類。6號材料也單獨(dú)聚為一類，為第Ⅴ類，來自中國西藏的麻豌豆G0004524，粒形扁形，光滑，粒色紫黑，不同于其他材料。從聚類圖來看，6號材料與其他材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

遺傳多樣性的表達(dá)主要是通過對遺傳多態(tài)性的標(biāo)記來反映的，可通過某個(gè)表型特征、特異的DNA片段或特異的同工酶帶型及蛋白質(zhì)作為目的基因直接或間接的標(biāo)記，來研究基因的變異和遺傳規(guī)律[13]。豌豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究起步較晚，目前有關(guān)豌豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究主要通過相關(guān)田間農(nóng)藝性狀的調(diào)查來實(shí)現(xiàn)[14-15]。自1959年Market首次提出了同工酶的概念以來，有關(guān)同工酶的研究就很快發(fā)展起來。過氧化物酶也可以用來推測各分類群之間的親緣關(guān)系，進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析。本研究23份供試豌豆材料過氧化物酶同工酶圖譜在酶帶數(shù)、酶帶濃度、酶帶顏色深淺、擴(kuò)散程度及遷移率上都有明顯差別。對過氧化物酶同工酶酶譜分析，由負(fù)極向正極可分為A、B、C 3個(gè)區(qū)域，分離出161條酶帶，酶帶類型為14種，酶帶最多是8條酶帶，最少是5條酶帶，A區(qū)和B區(qū)各有一條共有表達(dá)酶帶，C區(qū)Rf=0.62～0.83，有7種類型酶帶，沒有共有酶帶，但C區(qū)的酶帶數(shù)、酶帶顏色深淺變化豐富，表現(xiàn)出較強(qiáng)的多態(tài)性。23份材料中有兩條共有酶帶，又有各自的特征酶帶，既顯示出豌豆物種具有一定程度的遺傳穩(wěn)定性，也蘊(yùn)涵著豐富的區(qū)域差異性及遺傳多樣性。

圖3 23份豌豆材料同工酶酶譜性狀聚類圖

酶譜相似系數(shù)計(jì)算所得23份供試豌豆材料間的遺傳相似度在0.33～1.00之間，聚類分析結(jié)果表明：1、2號豌豆材料聚為一類，都來自于中國西藏，比較1、2號材料的酶譜，A區(qū)、B區(qū)酶譜特征幾乎一樣、C區(qū)2號材料少了一條酶帶。來自于中國6個(gè)省和自治區(qū)的麻豌豆系列聚為一大類，其中3號與17號材料、8號與16號材料、12號與13號材料相互間的親緣關(guān)系最近，酶帶幾乎一樣，相似系數(shù)為1。來自于中國四川的白豌豆，中國寧夏的藍(lán)豆，中國臺灣的臺中11(莢豌豆)，澳大利亞的IFPI 3917、CRIMSON ROSE聚為一大類。來自于澳大利亞的品種JI.1089，單獨(dú)一類； 6號材料中國西藏麻豌豆G0004524，也單獨(dú)聚為一類，其酶帶數(shù)較少，為6條，與其他材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。以上結(jié)果表明豌豆過氧化物酶同工酶與品種有關(guān)系，如大多數(shù)麻豌豆系列聚為一大類；也與其地理分布有著很大的關(guān)系。曾亮用ISSR標(biāo)記技術(shù)對來自國內(nèi)外的73份豌豆材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，基本符合地理來源相近的材料聚為一類，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律；曾亮還對120份豌豆材料的20個(gè)表型性狀分析，表明豌豆屬植物種質(zhì)資源形態(tài)變異十分豐富，國內(nèi)和國外群體內(nèi)差異顯著[6]。本研究中豌豆分類與豌豆品種的粒形顏色有關(guān)，如來源于中國西藏的麻豌豆，粒形扁球、光滑、紫黑，不同于其他麻豌豆，其親緣關(guān)系與其它材料較遠(yuǎn)，單獨(dú)為一類。李紅等在對不同苜蓿品種過氧化物酶同工酶的分析中也得出，品種間的地理位置越近，同工酶也就越相似，酶譜的相似程度也就越高，相反則低，可以根據(jù)同工酶的差異來對品種進(jìn)行分類[16]。劉賀賀等應(yīng)用POD同工酶分析75份蕨麻材料的遺傳多樣性，結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞水平、分子標(biāo)記研究的結(jié)果一致[17]。利用過氧化物酶同工酶來探討種質(zhì)遺傳關(guān)系，具有周期短、成本低、操作簡便等優(yōu)勢。本研究的不足之處是所選用的材料較少，如果能與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等研究相結(jié)合，分類會更準(zhǔn)確。

總之，本試驗(yàn)的23份材料過氧化物酶同工酶酶譜分析結(jié)果表明：供試材料在同工酶系統(tǒng)中均表現(xiàn)出一些明顯的共同特征譜帶，顯示出豌豆物種具有一定程度的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)各材料的同工酶酶譜之間也表現(xiàn)出某些明顯的差異性，體現(xiàn)出豌豆物種蘊(yùn)涵著豐富的區(qū)域差異性及遺傳多樣性，為豌豆進(jìn)化、分類、種質(zhì)資源的保存及利用奠定基礎(chǔ)。