與腦心肌炎病毒衣殼蛋白相互作用宿主蛋白的篩選

謝晶瑩， 鄧盈盈， 韓玉梅， 張海霞， 李向茸， 李瓊毅， 馮若飛,3

(1. 西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730030；3. 甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心， 蘭州 730030)

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是一種重要的人畜共患病病原體，不僅會引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還會引起生殖障礙以及動物糖尿病等。EMCV的宿主譜很廣，在不同的物種間EMCV引起的臨床癥狀不同，即使在同一物種不同個(gè)體間引起的癥狀也不盡相同[1]。體外研究表明，其可在多種原代細(xì)胞系上生長繁殖，并可以引起細(xì)胞明顯的病理變化[2]。EMCV可以感染多種脊椎動物，如嚙齒類動物、豬和包括人類在內(nèi)的靈長類動物[3]。在病毒基因組編碼的4種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1是主要的抗原決定域，與病毒的抗原性相關(guān)，也與細(xì)胞表面的受體有相互作用[4-5]。VP1、VP2和VP3構(gòu)成EMCV外殼，在病毒感染以及宿主識別過程中發(fā)揮了舉足輕重的作用[6-7]。酵母雙雜交系統(tǒng)是比較常用的研究蛋白質(zhì)互作的實(shí)驗(yàn)方法[8-9]，雙雜系統(tǒng)有效的前提是下游報(bào)告基因的激活，這一過程是通過轉(zhuǎn)錄因子與上游激活序列(Upstream activating element，UAS)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。在雙雜篩選系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄因子分為兩個(gè)部分，分別是DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Transcription activation domain，AD)，BD區(qū)負(fù)責(zé)與UAS結(jié)合，AD區(qū)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始[10-12]。更有研究揭示出兩種不同蛋白的BD和AD區(qū)可以發(fā)生重組，進(jìn)而產(chǎn)生有生物活性的轉(zhuǎn)錄因子[13]。但是在BD和AD單獨(dú)存在的情況下，則不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而二者在空間上產(chǎn)生某種聯(lián)系時(shí)則會激活轉(zhuǎn)錄[14-15]。

目前EMCV的感染、復(fù)制以及致病相關(guān)的分子機(jī)制仍不十分明確。本研究應(yīng)用Dual hunter酵母雙雜交技術(shù)，以EMCV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3分別為誘餌構(gòu)建pDHB1-bait 重組蛋白表達(dá)載體，通過對BHK-21細(xì)胞cDNA文庫的篩選得到與衣殼蛋白特異性結(jié)合的宿主蛋白，為EMCV感染及其致病機(jī)理的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑

EMCV 毒株(PV21，ATCC)由西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供； DUAL hunter starter kit 購自瑞士Dualsystems Biotech 公司；培養(yǎng)基YPAD、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp(SD-D)、SD/-Leu/-Trp/-His(SD-T)和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade(SD-Q)等均購自Clontech 公司；限制性內(nèi)切酶SfiI 購自TaKaRa 公司；dNTP、Taq酶、10×Taqreaction buffer、病毒總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN 公司。

1.2 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建

應(yīng)用Primer 5.0，參照GenBank EMCV的基因序列(登錄號X74312)設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因VP1、VP2和VP3的引物，引物中引入SfiI酶切位點(diǎn)(表1)。

提取病毒總RNA后采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因，參照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行誘餌載體的構(gòu)建，將構(gòu)建成功的載體命名為pDHB1-VP1、pDHB1-VP2和pDHB1-VP3。

1.3 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測及毒性試驗(yàn)

按照DUAL hunter說明書的操作說明制備NMY51感受態(tài)細(xì)胞，將構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒和pDHB1質(zhì)粒各1.5 μg 應(yīng)用熱激法分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，涂布SD/-Leu平板，肉眼觀察克隆大小及形態(tài)特征，確定誘餌蛋白對酵母細(xì)胞是否有毒害作用。毒性實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行誘餌質(zhì)粒的自激活檢測，將誘餌質(zhì)粒及用于功能驗(yàn)證的質(zhì)粒pPR3-N和pOst1-NubI各1.5 μg共轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，各取50 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布SD-D、SD-T和SD-Q 不同營養(yǎng)缺陷型固體平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長情況。

表1 用于誘餌序列擴(kuò)增的引物

注：下劃線表示SfiI 位點(diǎn)

1.4 文庫篩選與互作蛋白鑒定

BHK-21 cDNA文庫委托TaKaRa 公司構(gòu)建，文庫的載體為pPR3-N，庫容量為2×106cfu。通過文庫載體pPR3-N與Bait共轉(zhuǎn)化NMY51感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行3-aminotriazole(3-AT)篩選壓力的確定，以最大的排除背景克隆對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。確定篩選壓力后將Bait質(zhì)粒與cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化NMY51感受態(tài)細(xì)胞，重懸液全部涂布于3-AT SD-Q篩選平板。平板上長出的白色克隆即是與Bait有互作的BHK-21 細(xì)胞蛋白。為了排除假陽性結(jié)果對實(shí)驗(yàn)的干擾，將誘餌質(zhì)粒與分離到的捕獲質(zhì)粒共轉(zhuǎn)NMY51后涂布SD-Q平板，30℃培養(yǎng)3 d，篩選平板上無菌落生長即為假陽性，予以排除。

用pPR3-N通用引物進(jìn)行捕獲質(zhì)粒序列測定，測序結(jié)果進(jìn)行Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)同源性分析及蛋白質(zhì)功能聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳及測序分析顯示大小分別為824、716和566 bp，符合預(yù)期(圖1)。將目的基因定向插入誘餌載體pDHB1獲得pDHB1-VP1、pDHB1-VP2和 pDHB1-VP3重組載體，經(jīng)酶切驗(yàn)證，表明各重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。

2.2 誘餌質(zhì)粒的自激活及毒性試驗(yàn)

轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的NMY51酵母菌接種在SD/-Leu平板，培養(yǎng)后可見紅色菌落且菌落形態(tài)及大小與空載體pDHB1 相似，表明誘餌蛋白對細(xì)胞無毒害作用(圖3)。

A為VP1基因瓊脂糖凝膠電泳(M：1 kb plus DNA Ladder ； 1～3：VP1基因PCR產(chǎn)物)； B為VP2基因瓊脂糖凝膠電泳(1～2：VP2基因PCR 產(chǎn)物；M：1 kb plus DNA Ladder)； C為VP3基因瓊脂糖凝膠電泳(1～3：VP3基因PCR 產(chǎn)物； M：1 kb plus DNA Ladder)

A為質(zhì)粒pDHB1-VP1雙酶切驗(yàn)證(M：1 kb plus DNA Ladder； 1～4: 質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)物)； B為質(zhì)粒pDHB1-VP2雙酶切驗(yàn)證(1～3：質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)物； M：1 kb plus DNA Ladder)； C為質(zhì)粒pDHB1-VP3雙酶切驗(yàn)證(M：1 kb plus DNA Ladder； 1～2: 質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)物)

將誘餌質(zhì)粒分別與pOst1-NubI、 pPR3-N 共轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株NMY51后涂布SD-D、SD-T和SD-Q 缺陷平板，進(jìn)行誘餌質(zhì)粒功能性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，pDHB1-VP1/VP2/VP3+pOst1-NubI 在SD-T和SD-Q 平板上均有大量白色菌落生長，pDHB1-VP1/VP2/VP3+pPR3-N 僅在SD-D 平板上有紅色菌落，在SD-T和SD-Q 平板上無明顯菌落生長，表明誘餌質(zhì)粒無自激活作用，可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)(圖4)。

A: Bait VP1; B: Bait VP2; C: Bait VP3; D: pDHB1 plasmid

2.3 大量篩選與Bait相互作用的陽性克隆

通過壓力篩選最終確定的VP1、VP2和VP3的文庫篩選壓力分別為SD-Q/2.5 mmol/L 3-AT，SD-Q和SD-Q/1.0 mmol/L 3-AT。誘餌質(zhì)粒與文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)后菌液涂布3-AT SD-Q篩選平板，平板上長出的白色克隆(圖5)，應(yīng)用pPR3-N 引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，可擴(kuò)增出條帶的，表明酵母菌中含有pPR3-N-prey質(zhì)粒(圖6)。將酵母菌落單克隆于SD-D液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行β-半乳糖苷酶分析，進(jìn)一步排除假陽性結(jié)果(圖7)。反應(yīng)孔中顏色的強(qiáng)弱指示了蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱，深藍(lán)色表示作用強(qiáng)，淡藍(lán)色表示作用弱，無顏色變化對應(yīng)的酵母克隆則為假陽性結(jié)果，予以排除。

A：誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP1功能驗(yàn)證；B：誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP2功能驗(yàn)證；C：誘餌質(zhì)粒pDHB1-VP3功能驗(yàn)證。1, 2 and 3 stand for pDHB1-bait+pPR3-N grow on SD-D, SD-T and SD-Q plates； 4, 5 and 6 stand for pDHB1-bait+pOst1-NubI grown on SD-D, SD-T and SD-Q plates

圖4 Bait功能驗(yàn)證

Figure 4 Functional assays of baits

A: Bait VP1; B: Bait VP2; C: Bait VP3

圖5 SD-Q篩選平板克隆生長情況

Figure 5 Clones on SD-Q screening plates after bait cotransformed with cDNA library

1～16:陽性克隆PCR驗(yàn)證產(chǎn)物；M：1 kb plus DNA Ladder

圖6陽性克隆PCR產(chǎn)物電泳圖

Figure 6 Gel electrophoresis for PCR products of positive clones

2.4 相互作用蛋白的驗(yàn)證與鑒定

將得到的捕獲質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含誘餌質(zhì)粒的NMY51中，SD-Q平板無菌落生長為假陽性，予以排除。結(jié)果顯示共得到與誘餌蛋白VP1有相互作用的BHK-21細(xì)胞蛋白11個(gè)，分別是RNA-binding protein 3(RBM3)、Mitochondrial Calcium Uniporter subunit(MCUb)、Proteasome assembly chaperone 4(Pac4)、Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B(Ppib)、Protein disulfide-isomerase A3(Pdia3)、Histone deacetylase 1(HD1)、Polyubiquitin-C(Ubc)、Calcyclin-binding protein (Cacybp)、Heat shock protein HSP 90-beta(HSP90-β)、Mitochondrial fission 1 protein(Fis1)和Cytochrome C oxidase 1。與VP2互作的蛋白9個(gè)，分別是：40S ribosomal protein SA(Rpsa)、HSP90-β、Selenoprotein K(SelK)、60S ribosomal protein L12(Rpl12)、Galectin-1、Growth hormone-inducible transmembrane protein(Ghitm)、NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4(ND4)、lympoid-restricted membrane protein和inactive rhomboid protein 1。與VP3互作的蛋白10個(gè)，分別是：Fis1、Ghitm、Galectin-1、Phosphate carrier protein、mitochondrial(PTP)、Glutathione S-transferase P1(GSTP1)、Phosphoglycerate kinase 1(Pgk1)、Heat shock protein HSP 70(HSP70)、Histone deacetylase 1(HD1)、Cytochrome C oxidase1和Protein kinase C inhibitor。

使用數(shù)據(jù)庫PANTHER( Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships)對篩選出的蛋白的分子功能和參與的生物學(xué)過程進(jìn)行分析。這些蛋白的功能包括蛋白結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性和結(jié)構(gòu)分子活性；參與生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞形成、細(xì)胞代謝、細(xì)胞發(fā)育過程、細(xì)胞定位和免疫反應(yīng)等多個(gè)生理過程(表2)。

3 討論

隨著酵母雙雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用，利用其篩選與病毒蛋白相互作用的宿主蛋白成為尋找抗病毒作用靶點(diǎn)的新途徑。本研究應(yīng)用Dual hunter系統(tǒng)，通過對BHK-21細(xì)胞 cDNA文庫的篩選，共得到24個(gè)分別與VP1、VP2和VP3互作的候選細(xì)胞蛋白，并在酵母細(xì)胞中初步驗(yàn)證了他們之間的相互作用。

表2 互作蛋白的功能聚類分析

在篩選得到的24種蛋白質(zhì)中，3種蛋白對刺激的應(yīng)答有關(guān)，分別是HSP70、HSP90β和Pdia3。HSP70最初是由Ritossa在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的，HSP70是HSP家族中一類最重要而且廣泛表達(dá)的熱休克蛋白，具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞耐熱、細(xì)胞抗氧化、機(jī)體免疫和分子伴侶等[17]。HSP70家族的成員表達(dá)受到熱應(yīng)激和有毒化學(xué)物質(zhì)，特別是砷、鎘、銅、汞等重金屬的強(qiáng)烈影響。HSP70是細(xì)胞蛋白質(zhì)折疊的重要組成部分，而且可以保護(hù)細(xì)胞免受壓力刺激的影響[18]。已有研究揭示在漢坦病毒感染過程中，病毒通過激活HSP70的表達(dá)以抑制細(xì)胞的凋亡達(dá)到持續(xù)性感染的目的[19]。HSP70可促進(jìn)寨卡病毒在A549細(xì)胞中的增殖及促炎性因子Tumor necrosis factor-α(TNF-α)、Interferon-β(IFN-β)的釋放[20]。但其在EMCV感染及復(fù)制過程中可能起到的作用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

HSP90蛋白是參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期控制、應(yīng)激調(diào)控、蛋白質(zhì)折疊、降解和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要分子伴侶，HSP 90是一種高度保守的蛋白質(zhì)，從細(xì)菌到哺乳動物不同生物中均有表達(dá)[21]。在哺乳動物細(xì)胞中，有兩個(gè)或多個(gè)編碼細(xì)胞內(nèi)Hsp90同源物的基因， Hsp90α與Hsp90β兩者在蛋白水平有很高的同源性。已有研究證實(shí)日本腦炎病毒的受體就是HSP90β[22]。HSP90除作為日本腦炎病毒的受體外還可以與傳染性囊病毒和登革熱病毒結(jié)合，作為它們的受體而促進(jìn)其對宿主的感染[23]，并且其在HBV 衣殼蛋白組裝過程中也發(fā)揮重要作用[24]。

蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶A3(Pdia 3)又稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白58 (Glucose-regulated protein，58 ku，GRP58)，該蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與凝集素伴侶鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin，CALR)和鈣聯(lián)結(jié)蛋白(Calnxin，CNX)相互作用，調(diào)節(jié)新合成的糖蛋白的折疊[25]。Pdia3蛋白是一種具有蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶活性的硫醇氧化還原酶，也是主要組織相容性復(fù)合物(Major histocompatibility complex，MHC)I類抗原肽復(fù)合體的一部分，它是抗原構(gòu)象的最終形成和將抗原從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提示到細(xì)胞表面所必需的[26]。研究表明，Pdia3在細(xì)胞因子依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起作用[27]，而且在豬瘟病毒石門株感染早期Pdia3基因表達(dá)發(fā)生上調(diào)[28]。

通過酵母雙雜交篩選得到的3種應(yīng)激相關(guān)的蛋白將是我們接下來研究工作的重點(diǎn)，而且蛋白之間互作可通過GST-Pull down、CO-IP等方法進(jìn)一步確定，但其相互作用機(jī)制，以及對EMCV增殖的影響仍需深入研究。