大葉鐵線蓮ISSR 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

任夏萌，李欣怡，丁群英

（西安文理學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西西安710000）

鐵線蓮是一類藤本植物，屬于毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（Clematis L.），其耐寒耐旱，并具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。鐵線蓮屬植物廣泛分布于除南極洲外的6 個(gè)大洲。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全世界約有355 種鐵線蓮屬植物，我國因國土面積較大而占比較大，約有147 種，大多數(shù)種類分布于中部和西南部[2]。在陜西秦嶺、巴山、喬山以及陜北等林區(qū)，皆發(fā)現(xiàn)過鐵線蓮屬植物，平均海拔為400～3 500 m。鐵線蓮屬植物只有少數(shù)是直立灌木或草本植物，大多都是多年生木質(zhì)或草質(zhì)藤本植物[3]，其品種繁多，花型和花色皆豐富多彩，且開花期長，被譽(yù)為“攀援植物皇后”。在日本和西方國家的很多公園和家庭花園里，都能見到鐵線蓮屬植物[4]。此外，該屬植物在民間常被中醫(yī)用作藥物來利尿通淋、祛風(fēng)止痛，具有明顯的藥用價(jià)值[5]。由于鐵線蓮屬植物存在較大的市場效益，因此，越來越多的人開始研究鐵線蓮屬植物。

遺傳標(biāo)記（Genetic Marker）是指可追蹤染色體、染色體某一些節(jié)段、某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。生物體任何可遺傳的基因突變導(dǎo)致的表型差異都可以作為遺傳標(biāo)記[6]。遺傳標(biāo)記有5 種類型，包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記（Morphological Marker）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（Cytological Marker）、生物化學(xué)標(biāo)記（Biochemical Marker）、免疫學(xué)標(biāo)記（Immune Genetic Markers）以及分子標(biāo)記（Molecular Marker）[7]。根據(jù)現(xiàn)有資料，發(fā)現(xiàn)遺傳標(biāo)記可用來分析鐵線蓮屬植物的親緣種屬的相關(guān)性以及遺傳變異多樣性等問題[8]。

和文志等[9]對鐵線蓮屬植物的遺傳標(biāo)記研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了生物化學(xué)標(biāo)記，其余類型的標(biāo)記在鐵線蓮屬植物中均有相關(guān)研究，其中，分子標(biāo)記因其不受外界影響、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。目前，對于其分子標(biāo)記的研究，大部分都基于PCR 技術(shù)，如SSR 標(biāo)記、RAPD 標(biāo)記、RFLP 標(biāo)記、AFLP 標(biāo)記、ISSR 標(biāo)記等。劉慶超等[10]對我國鐵線蓮屬植物分子生物學(xué)方面的研究進(jìn)行了系統(tǒng)介紹，指出我國目前已有的相關(guān)研究。普春霞等[11]利用RAPD 技術(shù)對12 種云南鐵線蓮屬植物進(jìn)行了RAPD 分析；孫正海等[12]對滑葉藤進(jìn)行了ISSRPCR 體系的建立及其優(yōu)化；張倩[13]對大葉鐵線蓮的化學(xué)成分進(jìn)行了研究；劉慧杰等[14]對毛茛科分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究；和文志等[15]對基于ISSR 標(biāo)記的鐵線蓮園藝品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建。鐵線蓮ISSR 技術(shù)研究起步較晚，國內(nèi)外有關(guān)鐵線蓮ISSR-PCR 體系優(yōu)化的報(bào)道較少，這在極大程度上制約了鐵線蓮遺傳分析、種質(zhì)資源鑒定等研究的深入[16]，因此，建立適合鐵線蓮的ISSRPCR 擴(kuò)增體系至關(guān)重要。

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記技術(shù)是由加拿大蒙特利爾大學(xué)的ZIETKIEWICZ 等[17]于1994 年提出的，是一種基于SSR（Simple Sequence Repeat）發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，其具有操作簡單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)無需知道任何靶序列的SSR 背景信息，大大降低了操作難度和試驗(yàn)成本。由于其眾多優(yōu)點(diǎn)，因此越來越多被用于種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析以及分子育種等研究。

本研究以秦嶺野生大葉鐵線蓮為試驗(yàn)材料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化模板DNA、Taq 酶、Mg2+和dNTPs 等影響因素，從而優(yōu)化大葉鐵線蓮ISSR-PCR 反應(yīng)體系，旨在為鐵線蓮遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系研究以及遺傳資源保護(hù)等工作提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為秦嶺大葉鐵線蓮，種植于西安文理學(xué)院生命與環(huán)境工程學(xué)院試驗(yàn)田。采取其幼嫩葉片，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 的提取及檢測 根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒說明書，提取大葉鐵線蓮基因組DNA。隨后以ddH2O 為空白對照，用NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)檢測所提取的DNA 純度（DNA 純度＝OD260/OD280），并通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA 是否可用于后續(xù)反應(yīng)[18]。

1.2.2 引物的篩選 試驗(yàn)所選引物為西安某生物公司的合成產(chǎn)品，同時(shí)參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）所公布的引物。用合適量程的移液槍分別吸取12.5 μL 的2×Es Taq Master Mix PCR 反應(yīng)液、2 μL DNA 模板、2 μL 引物（表1），加入到PCR 管中，并進(jìn)一步用ddH2O 補(bǔ)足25 μL，共13 組反應(yīng)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，退火（溫度取決于引物Tm 值）1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，吸取10 μL 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于5 V/cm 的電場中電泳40 min 后，再在紫外透射儀下觀察結(jié)果，并記錄。

表1 引物名稱、序列及Tm 值

1.2.3 ISSR-PCR 反應(yīng)單因素試驗(yàn) 試驗(yàn)選用引物11，選取4 個(gè)影響因素：Taq 酶濃度、模板DNA 濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度，各設(shè)定5 個(gè)濃度梯度，以單因素優(yōu)化法進(jìn)行4 組試驗(yàn)（表2），PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后使用紫外透射儀觀察擴(kuò)增效果，選出最優(yōu)條件。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

表2 大葉鐵線蓮ISSR-PCR 單因素試驗(yàn)水平

1.2.4 ISSR-PCR 反應(yīng)正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對PCR 反應(yīng)體系中的模板DNA 濃度、dNTPs濃度、Taq 酶濃度，Mg2+濃度各設(shè)定3 個(gè)梯度，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)（表3），PCR 擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用臺式紫外透射儀觀察擴(kuò)增效果。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

表3 大葉鐵線蓮ISSR-PCR 正交試驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 的制備

選擇生長狀態(tài)良好、幼嫩的葉片為材料，在提取時(shí)能夠獲得合適的基因組DNA，得到的大葉鐵線蓮基因組DNA 電泳圖譜如圖1 所示。從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來看，條帶清晰，背景明亮，所提取的基因組DNA 質(zhì)量較好，無RNA 和蛋白質(zhì)污染，基本滿足ISSR-PCR 反應(yīng)條件。通過NanoDrop 2000C 超微量分光光度計(jì)的檢測，提取的基因組DNA 濃度為20 ng/μL，OD260/OD280值為1.65，達(dá)到了ISSR-PCR 反應(yīng)的基本條件。

2.2 引物的篩選

引物共有13 條，其擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示，發(fā)現(xiàn)11 號引物條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象，條帶數(shù)量足夠，可以用于后續(xù)反應(yīng)。

2.3 ISSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

2.3.1 基因組DNA 濃度對ISSR-PCR 反應(yīng)體系的影響 模板濃度過低時(shí)，條帶易于變得模糊；模板濃度過高時(shí)，條帶背景亮度較大。擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖3 所示，5 種基因組DNA 加入量分別為20，40，60，80，100 ng。由圖3 可知，當(dāng)基因組DNA 加入量大時(shí)背景亮度增大，但差距不明顯，從經(jīng)濟(jì)角度考慮選擇40 ng 為最優(yōu)條件。

2.3.2 Taq 酶濃度對ISSR-PCR 反應(yīng)體系的影響Taq DNA 聚合酶用量過少則會引起擴(kuò)增量不足，過多會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖4 所示，在5 個(gè)濃度梯度中，2 U 濃度時(shí)背景清晰，所以選擇2 U 為最優(yōu)條件。

2.3.3 dNTPs 濃度對ISSR-PCR 反應(yīng)體系的影響dNTPs 是擴(kuò)增反應(yīng)的原料，參與新鏈DNA 的合成，它只有在一個(gè)最優(yōu)值時(shí)反應(yīng)才有最大效率，否則會抑制產(chǎn)物的形成。擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5 所示，共有0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mmol/L 等5 組濃度梯度。由圖5 可知，dNTPs 加入量大時(shí)背景亮度增大，但差距不明顯，從經(jīng)濟(jì)角度考慮選擇0.2 mmol/L 為最優(yōu)條件。

2.3.4 Mg2+濃度對ISSR-PCR 反應(yīng)體系的影響Mg2+作為Taq DNA 聚合酶的催化劑，顯著影響著酶的活性，進(jìn)而直接影響PCR 結(jié)果，過高的Mg2+濃度會降低反應(yīng)的特異性，而過低的Mg2+濃度會影響PCR產(chǎn)量，甚至導(dǎo)致PCR 擴(kuò)增失敗。擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6 所示，共有1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mmol/L等5 組濃度梯度，當(dāng)濃度為3.0 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增效果最好，所以選擇3.0 mmol/L 為最優(yōu)條件。

2.3.5 ISSR-PCR 反應(yīng)正交試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)（表3），試驗(yàn)結(jié)果如圖7 所示。根據(jù)所擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱、清晰度、重復(fù)性等進(jìn)行1～9 分計(jì)分，最佳組合記為9 分，最差組合記為1 分。9 個(gè)處理的評分結(jié)果依次為1，6，1，8，5，2，6，9，3，按照參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行計(jì)算，獲得的最佳反應(yīng)體系為處理8。

由表4 可知，處理8 的模板DNA 含量為40 ng，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，dNTPs 濃度為0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合濃度為2 U。

表4 ISSR-PCR 最佳反應(yīng)體系

3 結(jié)論與討論

DNA 樣品的質(zhì)量與濃度對后續(xù)ISSR-PCR 反應(yīng)的結(jié)果有著直接的影響，DNA 樣品的質(zhì)量與濃度對后續(xù)ISSR-PCR 反應(yīng)的結(jié)果有著直接的影響。高質(zhì)量的基因組DNA 有助于更好更快地優(yōu)化ISSR-PCR 反應(yīng)體系，因此，在提取時(shí)應(yīng)選擇生長良好及幼嫩的大葉鐵線蓮葉片為提取材料，采摘后應(yīng)迅速放入-20 ℃冰箱中保存（防止基因組DNA 降解，同時(shí)為后續(xù)提取工作做好準(zhǔn)備）。其次，采用康為世紀(jì)公司的植物基因組DNA 提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit）提取基因組DNA，其優(yōu)點(diǎn)有：采用先進(jìn)的硅膠膜技術(shù)和簡單的離心程序，無需乙醇沉淀，適合于簡單快速地分離得到高純度DNA。需要注意的是，在提取時(shí)需加入少量β- 巰基乙醇，防止DNA 褐化，且操作過程應(yīng)在通風(fēng)櫥進(jìn)行。本研究表明，提取過程結(jié)束后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測，提取的基因組DNA 在質(zhì)量和濃度上均符合要求，提取的基因組DNA 中RNA 和蛋白質(zhì)較少，測得OD260/OD280值為1.65，表明DNA 樣品無蛋白質(zhì)和RNA 污染，符合后續(xù)PCR 反應(yīng)要求。

在ISSR-PCR 反應(yīng)中，引物的作用是起始DNA復(fù)制，因?yàn)門aq DNA 聚合酶沒有起始復(fù)制的功能只有延伸的功能，所以需要一段引物來與DNA 模板結(jié)合起始復(fù)制。當(dāng)引物濃度太低時(shí)，不易與模板DNA 結(jié)合，不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物或者擴(kuò)增產(chǎn)物較少；當(dāng)濃度太高時(shí)，很容易引起非特異性擴(kuò)增或堿基錯(cuò)配，并且引物之間還可能形成二聚體或多聚體[20]。本試驗(yàn)共有13 條引物可供選擇，將13 條引物分別進(jìn)行PCR 反應(yīng)（25 μL 體系中加入12.5 μL 的2×Es Taq Master Mix PCR 反應(yīng)預(yù)混液，2 μL 引物，2 μL DNA 模板，再用ddH2O 補(bǔ)足25 μL），PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后根據(jù)電泳圖譜選擇一條引物用于后續(xù)反應(yīng)，其中11 號引物產(chǎn)生的條帶清晰，背景明亮，最終選擇了11 號引物用于后續(xù)的ISSRPCR 反應(yīng)體系優(yōu)化。

在PCR 反應(yīng)體系中，參與反應(yīng)的物質(zhì)有Taq DNA 聚合酶、模板DNA、4 種dNTPs、引物和Mg2+。本試驗(yàn)選擇了Mg2+、模板DNA、dNTPs、Taq DNA 聚合酶4 種物質(zhì)的濃度進(jìn)行優(yōu)化。模板DNA 作為直接參加反應(yīng)的物質(zhì)對PCR 的影響就是底物對于反應(yīng)的影響，模板濃度過低時(shí)，會導(dǎo)致產(chǎn)物穩(wěn)定性下降，且條帶易于變得模糊；模板濃度過高時(shí)，可能會有雜質(zhì)混入反應(yīng)體系，容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，所以選擇適中的濃度進(jìn)行ISSR 分析。

dNTPs 的主要功能是在PCR 的延伸步驟中，以堿基互補(bǔ)原則，在Taq 聚合酶的作用下連接待擴(kuò)增的模板，從而達(dá)到復(fù)制模板的目的。dNTPs 作為反應(yīng)的底物，參與新鏈DNA 的合成，只有在一個(gè)最優(yōu)值時(shí)，反應(yīng)才有最大效率，否則會抑制產(chǎn)物形成。

在一定濃度下，Taq 聚合酶濃度越高反應(yīng)速率越快，相同時(shí)間產(chǎn)生的產(chǎn)物也就越多，但是當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí)，酶濃度不再影響反應(yīng)速率。所以從經(jīng)濟(jì)角度考慮，在相同擴(kuò)增效果下選擇較低的Taq聚合酶濃度。

本試驗(yàn)通過單因素優(yōu)化法和正交試驗(yàn)對Mg2+，模板DNA、dNTPs、Taq DNA 聚合酶4 種物質(zhì)的濃度進(jìn)行篩選，最終確定適合于大葉鐵線蓮ISSR-PCR反應(yīng)的體系為：在25 μL 反應(yīng)體系中，最佳體系為1.0 μL 模板DNA、2.0 μL Mg2+、2.0 μL dNTPs、1.0 μL引 物 以 及0.2 μL Taq DNA 聚 合 酶 和18.8 μL ddH2O。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，47 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。使用該體系進(jìn)行ISSR-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增后均可出現(xiàn)清晰條帶，結(jié)果為今后的研究提供了保障。