馬鈴薯PGA1 基因的克隆及序列分析

閆建俊，白云鳳，左靜靜，裴成成，左 敏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科植物，是世界四大重要糧食作物之一，其具有種植范圍廣、產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富且易消化吸收等特點(diǎn)。2015 年，隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的啟動(dòng)，馬鈴薯的生產(chǎn)與加工在人們的日常生活和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的作用。但馬鈴薯塊莖中普遍存在一類具有澀味、帶毒性的糖苷生物堿，其已被公認(rèn)為是人類食物中最嚴(yán)重的有毒物質(zhì)之一[1]。塊莖中的生物堿主要是由光照、低溫以及機(jī)械損傷等產(chǎn)生[2]，當(dāng)塊莖中糖苷生物堿含量超過(guò)一定的閾值時(shí)，馬鈴薯的食味性和食用安全性便會(huì)受到嚴(yán)重影響，其食用、飼用及加工品質(zhì)也隨之降低[3]。

糖苷生物堿又常被稱為甾體糖苷生物堿（Steroidal Glycoalkaloids，SGAs），其是廣泛存在于植物中的一類重要的次生代謝物，主要存在于茄科和百合科植物中[4-5]，例如存在于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的番茄和馬鈴薯中[6]。目前，已發(fā)現(xiàn)的糖苷生物堿種類超過(guò)100 種，平均每年仍有2～3 種新的種類被鑒定發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中被鑒定的生物堿種類也超過(guò)了80 多種[6-8]。在馬鈴薯中，α- 茄堿和α- 查茄堿是栽培種中的2 種主要存在形式，其占到糖苷生物堿總量的95%[9]。在某些野生種和栽培種品種中，還存在一些其他形式的糖苷生物堿，如茄解啶、垂茄啶、番茄啶和萊普亭啶等[10]。馬鈴薯的芽、皮和芽眼周?chē)植贾^多的糖苷生物堿，主要對(duì)呼吸系統(tǒng)和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中樞神經(jīng)具有毒性，并對(duì)生物黏膜具有溶解和破壞作用，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)致畸甚至致死[11]。通常，馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿符合健康標(biāo)準(zhǔn)的含量為0.01～0.10 mg/g，最高不能超過(guò)0.20 mg/g[10]。關(guān)于糖苷生物堿毒性的研究已引起國(guó)內(nèi)外研究人員的高度重視，尤其成為從事食品安全和醫(yī)療保健人員的研究熱點(diǎn)。

本研究利用RT-PCR 技術(shù)對(duì)馬鈴薯糖苷生物堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因PGA1 進(jìn)行了克隆，并利用生物信息學(xué)軟件分析PGA1 基因的結(jié)構(gòu)，而且預(yù)測(cè)了PGA1 基因編碼蛋白的物理性質(zhì)及功能等，以期為深入研究分析PGA1 基因的功能提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)，通過(guò)RNAi 技術(shù)或基因編輯技術(shù)調(diào)控生物堿的合成尋求新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

供試馬鈴薯品種為大西洋，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室保存。

RNA 提取所用的Trizol 為Invitrogen 公司生產(chǎn)；RT-PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒購(gòu)于北京艾德萊生物科技有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector 克隆載體購(gòu)于北京全式金公司；由北京華大基因公司完成引物的合成及測(cè)序工作；其他試劑購(gòu)自國(guó)內(nèi)外各廠家，均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯總RNA 的提取及cDNA 的合成 采用山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)室改進(jìn)的方法[12]提取馬鈴薯總RNA，以馬鈴薯品種大西洋無(wú)菌苗葉片為材料，通過(guò)液氮速凍、研磨后加入Trizol 試劑，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。提取完成后，采用非變性的1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA 質(zhì)量。以提取的總RNA 為模板，按照TaKaRa 公司RT-PCR 試劑盒說(shuō)明轉(zhuǎn)錄合成cDNA 的第1 鏈。

1.2.2 馬鈴薯PGA1 基因的克隆 根據(jù)PGA1 基因已報(bào)道的序列（序列號(hào)為AB839752.1），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)RT-PCR 引物：正向引物為5′-ATGGCAATTGCAACAGTAATTG-3′，反向引物為5′-TCAAAGCTTGTTGAGGATTATC-3′。以合成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為ddH2O33.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 正向引物和反向引物各2.5 μL，EX Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 5 μL，總體積50 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，回收目的條帶純化后連接到pEASY 克隆載體上，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、涂平板，挑取單克隆并于加有AMP＋的LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖菌，通過(guò)PCR 擴(kuò)增菌液，選取呈陽(yáng)性的菌液送至北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 馬鈴薯PGA1 基因序列分析 將克隆得到的序列通過(guò)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線網(wǎng)站和MEGA 7.0 軟件進(jìn)行Blast 比對(duì)分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用Generunner 軟件翻譯得到PGA1 基因的氨基酸序列，用ProtParam 對(duì)推導(dǎo)獲得的氨基酸的組成、理論分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行在線分析[13]，通過(guò)PSORT（http：//psort1.hgc.jp/form.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。PGA1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)通過(guò)TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線分析，用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale）軟件預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性，使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）在線分析PGA1 基因編碼多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)[14]，蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)在線軟件SWISSMODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）分析[15]，采用SignalP 4.0 軟件系統(tǒng)分析蛋白的信號(hào)肽序列[16]，其他相關(guān)在線網(wǎng)站及軟件的使用參照文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯PGA1 基因的克隆及序列特征分析

利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的馬鈴薯總RNA，電泳結(jié)果顯示（圖1），28SrRNA、18S rRNA條帶清晰，RNA 完整性較好，可用于下一步試驗(yàn)。采用TaKaRa 公司的RT-PCR 試劑盒將提取的總RNA 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 的第1 鏈。利用特異性引物對(duì)PGA1 基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得約1.5 kb 的片段（圖2）?；厥赵撈危cpEASY 克隆載體連接，然后將重組陽(yáng)性質(zhì)粒送至北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果表明，試驗(yàn)獲得的PGA1 基因的CDS序列長(zhǎng)為1 497 bp，其中，（G＋C）含量占38.81%，（A＋T）含量占61.19%。NCBI 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，克隆的基因序列與已報(bào)道PGA1 序列相似性達(dá)到99.2%，可能是由于克隆基因所用的品種差異造成的差別，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建PGA1 遺傳進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯PGA1 基因與潘那利番茄（Solanum pennellii）屬于同一分支，親緣關(guān)系最近（圖3）。用Generunner軟件推導(dǎo)獲得PGA1 基因的氨基酸序列（圖4），該基因編碼498 個(gè)氨基酸。用ProtParam 對(duì)馬鈴薯PGA1 基因序列進(jìn)行在線分析可知，該基因分子質(zhì)量為57.087 ku，理論等電點(diǎn)為9.29，蛋白分子式為C2624H4104N678O696S25，PGA1 蛋白帶完全正電荷的氨基酸殘基賴氨酸、精氨酸總和為63 個(gè)，帶完全負(fù)電荷的谷氨酸與天冬氨酸總和為48 個(gè)，不穩(wěn)定性系數(shù)為42.76（＞40），表明該蛋白是不穩(wěn)定性蛋白。

2.2 蛋白質(zhì)疏水性分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

馬鈴薯PGA1 蛋白的親/ 疏水性預(yù)測(cè)通過(guò)ProtScale 在線軟件進(jìn)行分析（大于0 表示疏水性，小于0 表示親水性），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），預(yù)測(cè)的最大值出現(xiàn)在第15 個(gè)氨基酸處，分值為3.167，疏水性最強(qiáng)；最小值出現(xiàn)在第146 個(gè)氨基酸處，分值為-3.000，親水性最強(qiáng)。

使用SOPMA 在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，PGA1 基因所編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋、β 轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲4 部分組成，其中，261 個(gè)氨基酸可能參與形成α 螺旋，占52.41%；30 個(gè)氨基酸可能參與形成β 轉(zhuǎn)角，占6.02%；64 個(gè)氨基酸可能參與形成延伸鏈，占12.85%；143 個(gè)氨基酸可能參與形成無(wú)規(guī)則卷曲，占28.71%，α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是其主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件，β轉(zhuǎn)角和延伸鏈分散在整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)中（圖6）。

利用SWISS-MODEL 在線分析工具，對(duì)PGA1基因編碼的蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示（圖7），馬鈴薯PGA1 編碼的蛋白的三維結(jié)構(gòu)主要以α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

2.3 蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位分析

采用PSORT 工具預(yù)測(cè)馬鈴薯PGA1 蛋白最有可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用TMHMM2.0 在線分析了馬鈴薯PGA1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖8），該蛋白第30—498 位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，第7—29 位氨基酸之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果一致，表明該蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。

通過(guò)SignalP 4.0 Server 軟件系統(tǒng)在線分析了馬鈴薯PGA1 基因的信號(hào)肽序列，結(jié)果顯示（圖9），該蛋白的氨基酸序列不具備信號(hào)肽序列，是非分泌型蛋白。

3 結(jié)論與討論

塊莖中馬鈴薯糖苷生物堿含量過(guò)高會(huì)影響人畜安全，但其也存在積極作用。有研究表明，該類次生代謝物能夠增強(qiáng)植物的抗病性、抗蟲(chóng)性等，是植物防御病蟲(chóng)害的化學(xué)屏障[18-19]。因此，科研人員育種時(shí)，最為理想的是獲得馬鈴薯地上部分生物堿含量高而塊莖中含量低的品種，而通過(guò)常規(guī)育種手段很難實(shí)現(xiàn)。

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào)控糖苷生物堿的合成可為育種人員開(kāi)辟一條新途徑。目前，關(guān)于糖苷生物堿合成代謝研究的報(bào)道還比較缺乏，但部分合成代謝途徑的關(guān)鍵基因及酶已取得了一定進(jìn)展，如已經(jīng)鑒定出同時(shí)調(diào)控α-茄堿合成的茄啶半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因SGT1 和SGT2，同時(shí)調(diào)控α- 卡茄堿的茄啶鼠李糖轉(zhuǎn)移酶基因SGT2 和SGT3[20-22]，以及最新鑒定出的編碼糖苷生物堿合成通路關(guān)鍵酶基因CYP450 單加氧酶基因等[23]。另外，在馬鈴薯糖苷生物堿的合成途徑中，還有很多關(guān)鍵基因及酶發(fā)揮重要的調(diào)控作用，研究并了解這些合成代謝相關(guān)酶的功能機(jī)制具有非常重要的意義。

本研究通過(guò)對(duì)馬鈴薯栽培品種大西洋中糖苷生物堿合成關(guān)鍵酶PGA1 基因進(jìn)行克隆，得到長(zhǎng)為1 497 bp、編碼498 個(gè)氨基酸的基因序列；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯PGA1 蛋白主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。信號(hào)肽分析表明，馬鈴薯PGA1 蛋白不含信號(hào)肽，屬于非分泌型蛋白。氨基酸序列進(jìn)化分析結(jié)果表明，PGA1 與野生番茄資源潘那利番茄的親緣關(guān)系最近，都是茄科作物，符合物種進(jìn)化規(guī)律。

本研究通過(guò)對(duì)馬鈴薯PGA1 基因的克隆和初步分析，有利于對(duì)PGA1 基因編碼蛋白的功能進(jìn)行深入研究，有助于了解馬鈴薯糖苷生物堿的合成機(jī)制。今后將嘗試通過(guò)基因編輯技術(shù)對(duì)PGA1 基因進(jìn)行干擾，并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究，探討通過(guò)基因編輯技術(shù)調(diào)控馬鈴薯糖苷生物堿含量的新技術(shù)。