不同檢測方法對石蠟組織塊的結(jié)核分枝桿菌檢測的對比分析

蔣麗超，鐘定榮，楊 銳，吳俊秀，王 也，姜睿盈，于婉超

（中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病，對人體危害很大。長期以來，結(jié)核病由于其強(qiáng)烈傳染性，一直困擾大眾。組織標(biāo)本應(yīng)用抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌，其敏感性低，使得檢出的陽性率低，難以滿足患者和臨床的精準(zhǔn)診療需求[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，因其具有較高的敏感性和特異性而廣泛應(yīng)用于各種病原體的核酸檢測[2]。

本文對2017～2019年中日友好醫(yī)院病理科168例病理形態(tài)疑為肺結(jié)核病患者的石蠟包埋組織抗酸染色、熒光PCR 法以及PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行對比分析，旨在評價(jià)不同檢測方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

2017年1月～2019年1月我科病理形態(tài)疑為肺結(jié)核病患者168例，其中男80例、女88例；年齡15～86 歲，平均51.45 歲。中位數(shù)年齡53.5 歲。

1.2 方法

1.2.1 抗酸染色法

組織切片脫蠟至水，應(yīng)用BenchMark 全自動(dòng)特殊染色機(jī)進(jìn)行染色。結(jié)果判定：鏡下見到鮮紅色桿狀、略彎曲、串珠狀的抗酸桿菌為陽性。

1.2.2 熒光PCR 檢測

對組織切片進(jìn)行脫蠟處理后，提取DNA（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司），然后按照程序進(jìn)行DNA 擴(kuò)增和分析（ABI7500，美國）。結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件，以Ct 值的范圍來判定結(jié)核分枝桿菌的檢測結(jié)果：Ct＜16 為強(qiáng)陽性，16～22 為陽性，22～28 為弱陽性，＞28為陰性。

1.2.3 PCR-反向點(diǎn)雜交法

對組織切片進(jìn)行脫蠟處理后，提取DNA（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司），進(jìn)行DNA 擴(kuò)增及雜交（ABI7500），取出膜條浸泡顯色液中（亞能生物技術(shù)有限公司），避光顯色后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：根據(jù)膜條上藍(lán)色斑點(diǎn)顯現(xiàn)的位置，讀取相應(yīng)位置標(biāo)注的基因型信息。

2 結(jié)果

以形態(tài)學(xué)可見上皮樣肉芽腫性炎，并伴干酪樣壞死為肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，168例病理形態(tài)學(xué)疑似肺結(jié)核病患者中有51例病理診斷確診為肺結(jié)核病。

表1～表4示，168例疑似患者抗酸染色法、 熒光PCR法以及PCR-反向點(diǎn)雜交法的陽性率分別是20.8%、29.1%、13.7%；抗酸染色法、熒光PCR 法以及PCR-反向點(diǎn)雜交法的靈敏度分別是51.0%、66.7%、35.2%；特異度分別是92.3%、87.1%、95.7%； 準(zhǔn)確度分別是80.0%、81.0%、77.4%。

其中抗酸染色法特異度（92.3%）最高，熒光PCR 法的陽性率（29.1%）、靈敏度（66.7%）及準(zhǔn)確度（81.0%）最高，綜合評價(jià)熒光PCR 法優(yōu)于其他2 種方法。

3 討論

病理診斷中常用抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌，抗酸染色法被視為診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，是最經(jīng)典、常用檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，具有操作方便，價(jià)格便宜的優(yōu)點(diǎn)，且是最直觀可見結(jié)核桿菌的方法，但其陽性率（20.8%）略低。由于組織學(xué)染色是一種多步驟診斷過程，染色前對組織的處理和加工過程中存在人為因素影響，如染色時(shí)間、切片厚度、鏡檢經(jīng)驗(yàn)等因素，易出現(xiàn)假陰性或者假陽性。應(yīng)用智能特染機(jī)器進(jìn)行抗酸染色，一定程度上避免了人為操作失誤，使其準(zhǔn)確度得到了一定提升。病理診斷判定標(biāo)準(zhǔn)是找到抗酸染色陽性桿菌，但其陽性結(jié)果顯示既可能是結(jié)核桿菌，也可能是非結(jié)核分枝桿菌或者麻風(fēng)桿菌等，所以需要我們應(yīng)用其它檢測手段，即PCR-反向點(diǎn)雜交法輔助診斷。

表1 3 種檢測方法對比結(jié)果 （%）

表2 抗酸染色和病理形態(tài)學(xué)診斷肺結(jié)核的對比結(jié)果 （n）

表3 熒光PCR 法和病理形態(tài)學(xué)診斷肺結(jié)核的對比結(jié)果 （n）

表4 PCR-反向點(diǎn)雜交法和病理形態(tài)學(xué)診斷肺結(jié)核的對比結(jié)果 （n）

熒光PCR 法為專項(xiàng)檢測結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)方法，其陽性率（29.1%）是3 種方法中最高的，雖然在結(jié)果評定中存在假陽性的可能，對于存在界限不清者可重復(fù)操作多次，確保結(jié)果準(zhǔn)確。且其靈敏度（66.7%）對比其他2 種檢測方法高，優(yōu)勢顯著，但其單一性具有一定局限，使得此方法僅適用于結(jié)核分枝桿菌檢測。PCR-反向點(diǎn)雜交法的靈敏度（35.2%）和準(zhǔn)確性（77.4%）均不高，且其陽性率（13.7%）較低，存在很大的漏診率。但是PCR-反向點(diǎn)雜交法特異性（95.7%）最高，可以檢測不同類型分枝桿菌，既可以鑒定抗酸染色陽性是否為結(jié)核分枝桿菌抑或是其他類型分枝桿菌，也可輔助抗酸染色的結(jié)果證明，使得判定結(jié)果更加準(zhǔn)確[3]。無論是哪一類檢測方法，用石蠟組織塊都存在實(shí)驗(yàn)中含有石蠟雜質(zhì)，抑制試劑反應(yīng)均易出現(xiàn)假陰性，在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求操作，減少誤差，避免交叉污染[4]。

雖然目前沒有一種方法可以完全取代其他方法作為病理診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)，但綜合評價(jià)對比分析，熒光PCR 法優(yōu)于其他2 種方法，可作為肺結(jié)核病診斷的優(yōu)選方法[5]。在實(shí)際工作中，可以選擇多種方法聯(lián)合檢測，并結(jié)合患者的病史、臨床癥狀、影像及病理等資料，對肺結(jié)核病做出正確的診斷，可以有效減少誤診、漏診的發(fā)生[2]。