基于高通量測序探討印楝素對薄殼山核桃林地土壤微生物的影響

尹華陽，郭婉琳，董廣平，方建民，劉洪劍，李曉娟

（安徽省林業(yè)科學研究院，合肥230031）

薄殼山核桃（Carya illinoensis），又名美國山核桃、長山核桃，為胡桃科山核桃屬的落葉喬木，原產(chǎn)于美國和墨西哥北部，是一種品質(zhì)優(yōu)良的高檔干果和油料樹種[1-2]，亦為優(yōu)良的材用和園林綠化樹種，具有極高的經(jīng)濟價值和觀賞價值。我國于19 世紀末開始引種栽培薄殼山核桃，目前主要集中在江蘇、浙江、云南、陜西、安徽、江西和湖南等地[3]。隨著種植面積的逐步擴大，各種蟲害（如天牛、咖啡豹蠹蛾、桃蛀螟、山核桃透翅蛾、蚜蟲、葉甲等）頻繁發(fā)生，對薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴重的威脅。

目前，對薄殼山核桃蟲害的防治方法主要有人工捕殺和藥物防治兩種[4-5]。前者成本較高且防治效果受人主觀因素影響較大；后者雖效果明顯，但化學農(nóng)藥的過度使用不僅對人類健康造成危害，而且對環(huán)境尤其是土壤也產(chǎn)生了嚴重的影響。

印楝素（azadirachtin）作為一種新型的植物源農(nóng)藥，具有廣譜、低毒，不易產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境相容性好等優(yōu)點[6]，對天牛有較好的防治作用。目前，對印楝素的研究主要為對昆蟲的毒理作用以及對人和動物的安全性評價等方面[7-8]，而印楝素對土壤微生物的研究鮮有報道。本文以高通量測序技術為基礎，對印楝素處理的薄殼山核桃林土壤微生物進行研究，將有利于多方面評價印楝素殺蟲劑，同時期望能有效指導印楝素及含印楝素的殺蟲劑開發(fā)和推廣應用。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于安徽省滁州市沙河鎮(zhèn)國家林草局山核桃工程技術研究中心基地薄殼山核桃林地，薄殼山核桃林株行距為3 m×4 m，樹齡為3 年；土壤為黃棕壤，土層深厚、質(zhì)地黏重，pH 值在6.0 左右。

1.2 試驗設計

試驗在有效殺蟲濃度范圍內(nèi)設3 個處理，分別是：對照組（CK），不施藥；300 倍稀釋組（A300），采用1%印楝素（北京琳海植?？萍脊煞萦邢薰荆?00 倍稀釋液1 000 mL 對薄殼山核桃進行灌根處理；600倍稀釋組（A600），采用1%印楝素600 倍稀釋液1 000 mL 對薄殼山核桃進行灌根處理。在試驗地內(nèi)選取樹況相似的薄殼山核桃進行處理，每個處理組各處理3 株，共計9 株，各株間距均大于5 m。

各組處理完成30 d 后采集土壤樣品，以樹干基部為圓心半徑20 cm 處挖坑取土。每株取3 個不同深度的土壤，土壤深度分別為距表面10～15 cm、30～35 cm、50～55 cm，每組設3 次重復，共取得27 份土壤樣品，置于已消毒的自封袋中，干冰保存帶回實驗室，實驗室-80 ℃冰箱保存。

1.3 土壤微生物DNA 提取、測序及處理

從樣品中提取基因組DNA 后，用帶有barcode 的特異引物分別擴增細菌16S rDNA 的V3+V4 區(qū)（引物序列為KYO2F:GATGAAGAACGYAGYRAA；ITS4R:TCCTCCGCTTATTGATATGC）以及真菌ITS rDNA 的ITS2 區(qū)（引物序列為 341F: CCTACGGGNGGCWGCAG；806R；GGACTACHVGGGTATCTAAT）。

擴增體系為：50 μL 反應體系中包含5 μL 的10×KOD Buffer，5 μL 的2.5 mM dNTPs，1.5 μL 引 物（5μM），1 μL 的KOD 聚合酶和100 ng 模版DNA。擴增條件為：95 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，62℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共27 個循環(huán)，最后68℃延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM 熒光計進行定量。將純化的擴增產(chǎn)物進行等量混合，連接測序接頭，構建測序文庫，Hiseq2500 PE250 上機測序。

測序后得到的初始數(shù)據(jù)有一些質(zhì)量不高，容易干擾分析結(jié)果，因此需要進行數(shù)據(jù)預處理。去除N比例過高的序列：去除reads 中N 堿基占比超過10%的序列；去除低質(zhì)量序列：去除質(zhì)量值高于20的堿基數(shù)占堿基總數(shù)的百分比小于40%的reads。根據(jù)reads 之間的重疊關系，使用FLASH 將成對雙端reads 拼接為一條序列，得到原始Tags 數(shù)據(jù)（Raw Tags）。拼接得到的RawTags。需要經(jīng)過更嚴格的過濾處理后[9]，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)（Clean Tags）。參照Qiime（V1.9.1）[10]的Tags 質(zhì)量控制流程，進行Tags 截取：將Raw Tags 從連續(xù)低質(zhì)量值（默認質(zhì)量閾值為<=3）堿基數(shù)達到設定長度（默認長度值為3）的第一個低質(zhì)量堿基位點截斷；Tags 長度過濾：Tags 經(jīng)過截取后得到的Tags 數(shù)據(jù)集，進一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags 長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理后得到的Tags 序列與數(shù)據(jù)庫（UCHIME Algorithm）進行比對[11]檢測嵌合體序列，去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。

1.4 物種注釋與豐度計算

為了研究樣品的物種的組成多樣性信息，用Uparse（usearch v9.2.64） 軟件對所有樣品的全部Effective Tags 序列聚類。默認提供以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）結(jié)果，并計算出每個OTU 在各個樣品中的Tags 絕對豐度和相對信息。在構建OTUs 的過程中選取代表性序列（OTUs 中豐度最高的那條Tag 序列），用RDP Classifier（version 2.2）與物種注釋的數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，得到采集土壤樣品中微生物物種豐度。

1.5 多樣性計算

基于OTU 的豐度結(jié)果，使用Qiime 軟件計算各個土壤樣品的α 多樣性，包括：chao1 值、ACE 值、Shannon 以及Simpson 指數(shù)等，用于指示土壤樣本的物種豐富度和均勻度等信息。

根據(jù)所有樣品的OTU 序列，使用軟件Muscle（v3.8.31）進行多序列比對，然后使用軟件TreeBeST（v1.9.2）構建OTU 之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄殼山核桃土壤樣品中細菌及真菌的測序結(jié)果

對土壤樣品測序下機數(shù)據(jù)得到的序列進行篩選，最終27 個樣品16S rDNA 高變區(qū)測序共測得有效序列數(shù)2 804 288 個，OTUs 數(shù)130 662 條；ITS rDNA 高變區(qū)測序共測得有效序列數(shù)2 208 825 個，OTUs 數(shù)9 163 條。每個樣品的有效序列數(shù)均大于70 000 個，滿足后續(xù)的物種豐度和多樣性指數(shù)分析要求。

2.2 薄殼山核桃土壤樣品細菌16S rDNA V3+V4區(qū)測序結(jié)果

2.2.1 不同施藥處理薄殼山核桃土壤樣品細菌種類熱圖比較

在科的水平對樣品細菌聚類后，對樣品中OTUs包含的序列的豐度繪制熱圖（見圖1），熱圖中每列代表一個樣本，每行代表一個分類水平，顏色從紅到藍表示豐度從高到低，由此可以清楚從顏色梯度的不同觀察到數(shù)據(jù)的差異，從而發(fā)現(xiàn)不同處理樣本間發(fā)生的變化。從圖中可以看出土壤深度為距表面10～15 cm各樣品中，A300 組和CK 組相比無較大變化，A600組的鏈霉菌科（Streptomycetaceae）、芽胞桿菌科（Bacillaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）等菌類的豐度有所降低；土壤深度為距表面30～35 cm 各樣品中，與CK 組相比，A300組和A600 組的鏈霉菌科、芽單胞菌科、鞘脂單胞菌科等菌類的豐度有所降低，A600 組的假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、根瘤菌科（Rhizobiaceae）的菌類豐度有所升高；土壤深度為距表面50～55 cm 各樣品中，A300 組的鞘脂單胞菌科、硫還原菌科（Desulfurellaceae）的菌類豐度與CK 組相比有一定程度的降低，A600 組和CK 組相比變化不明顯。

圖1 不同施藥處理下不同深度土壤樣品細菌種類

對所有土壤樣品測得的OTUs 所對應的生物分類信息進行統(tǒng)計分析表明，130 662 條OTUs 分屬于10 個門，分別是變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、匿桿菌門（Latescibacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。其中變形菌門和酸桿菌門這兩個菌門在樣本中所占比例達10%以上，這說明不同處理薄殼山核桃土壤樣品中的優(yōu)勢菌門為這兩類。

2.2.2 不同施藥處理薄殼山核桃土壤樣品細菌α 多樣性指數(shù)分析

α 多樣性是指特定生境或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性情況，它可以指示生境被物種隔離的程度，通常利用物種豐富度（種類情況）與物種均勻度（分布情況）兩個重要參數(shù)來計算。Chao1 指數(shù)主要關心樣本的物種豐富度信息；observed_species 指數(shù)表示能檢測到的OTU 種類情況；Shannon 指數(shù)主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度和均勻度。為了直觀分析各組之間α 多樣性指數(shù)差異，我們繪制了各個α 多樣性指數(shù)箱線圖（見圖2）。

由圖2 可以看出，不同施藥處理薄殼山核桃淺層 土 壤（10～15 cm） 樣 品 的 Chao1 指 數(shù)、observed_species 指數(shù)和Shannon 指數(shù)差異不大；中層土壤（30～35 cm）CK 組、A300 組和A600 組樣品的3 個α 多樣性指數(shù)有逐漸下降的趨勢；深層土壤（50～55 cm）樣品中CK 組和A600 組的指數(shù)差異不明顯，而A300 組的指數(shù)明顯低于另外兩組。這表明印楝素對薄殼山核桃林土壤細菌多樣性和豐度造成了一定影響。其中對淺層土壤細菌影響較小；對中層土壤細菌600 倍稀釋的印楝素藥液影響相較300倍稀釋更大；而深層土壤細菌受300 倍稀釋的印楝素藥液影響明顯，600 倍稀釋藥液幾乎無影響。

圖2 不同施藥處理土壤樣品細菌α 多樣性指數(shù)

2.3 薄殼山核桃土壤樣品真菌ITS rDNA ITS2 區(qū)測序結(jié)果

本研究對不同土層深度不同施藥處理的薄殼山核桃土壤樣品真菌ITS rDNA ITS2 區(qū)進行了擴增及測序，但對于不同施藥處理的深層土壤（50～55 cm）樣品擴增效果均不理想，可能由于深層土壤積水造成的真菌豐度較低導致。因此僅針對不同施藥處理薄殼山核桃淺層土壤（10～15 cm）樣品和中層土壤（30～35 cm）樣品進行后續(xù)分析。

2.3.1 不同施藥處理薄殼山核桃土壤樣品真菌種類熱圖比較

在科的水平對樣品真菌聚類后，對樣品中OTUs 包含的序列的豐度繪制熱圖（見圖3）。

由圖3 可以看出，土壤深度距表面10～15 cm 各樣品中，A300 組和 A600 組的革菌科（Thelephoraceae）、絲蓋傘科（Inocybaceae）和發(fā)菌科（Trichocomaceae）的菌類豐度相較于CK 組有所降低，A600 組的球蓋菇科（Strophariaceae）的菌類豐度相較于其余兩組有明顯升高。土壤深度距表面30～35 cm 各樣品中，A300 組和A600 組的絲蓋傘科和發(fā)菌科的菌類豐度相較于CK 組有較明顯的降低，A300 組的孢菌科（Pleosporaceae） 和扁孔腔菌科（Lophiostomataceae） 的菌類豐度較另兩組偏低，A600 組的間座殼科（Diaporthaceae）、毛殼菌科（Chaetomiaceae）和紅菇科（Russulaceae）的菌類豐度有一定程度的升高。

對土壤樣品測得的OTUs 所對應的生物分類信息進行統(tǒng)計分析，繪制物種分布堆疊圖（見圖4）。

圖4 不同施藥處理下不同深度土壤樣品真菌分布

由圖4 可以看出，9 163 條OTUs 分屬于3 個門： 子 囊 菌 門 （Ascomycota）、 擔 子 菌 門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota），其中子囊菌門和擔子菌門為山核桃林地土壤中最優(yōu)勢菌門。還可以看出，施300 倍稀釋印楝素藥液的淺層土壤（10～15 cm）樣品和中層土壤（30～35 cm）樣品擔子菌門真菌所占比例下降明顯，未歸類真菌比例增高。

2.3.2 不同施藥處理薄殼山核桃土壤樣品真菌α多樣性指數(shù)分析

對不同施藥處理薄殼山核桃土壤樣品真菌α多樣性指數(shù)繪制指數(shù)箱線圖，直觀分析各組之間α多樣性指數(shù)差異（見圖5）。

由圖5 可以看出，不同施藥處理薄殼山核桃淺層土壤（10～15 cm） 樣品真菌的Chao1 指數(shù)、observed_species 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均為CK 組＞A300 組＞A600 組；中層土壤（30～35 cm）樣品真菌的Chao1 指數(shù)和observed_species 指數(shù)為CK 組＞A300 組＞A600 組，但A300 組的Shannon 指數(shù)要明顯低于另外兩組，說明施300 倍稀釋印楝素藥液的中層土壤（30～35 cm）中真菌的豐度和均勻度明顯降低。總體趨勢上看，中層土壤真菌α 多樣性指數(shù)受施藥影響更明顯。

圖5 不同施藥處理土壤樣品真菌α 多樣性指數(shù)

3 討論

本文基于高通量測序技術比較分析了不同濃度印楝素對不同土層深度薄殼山核桃林地土壤微生物多樣性的影響。采集的所有樣本均分離出薄殼山核桃林樣地土壤中常見的變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌、放線菌門等細菌，以及子囊菌門和擔子菌門等真菌。通過16S 高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃深層土壤（50～55 cm）中細菌種類、豐度及均勻度受300 倍稀釋印楝素影響明顯，其中鞘脂單胞菌科、硫還原菌科的菌類豐度下降較多；施600 倍稀釋印楝素的淺層土壤（10～15 cm）中鏈霉菌科、芽胞桿菌科、芽單胞菌科等菌類的豐度有所降低，但α多樣性指數(shù)各組間差距不大；中層土壤（30～35 cm）中兩個施藥組的鏈霉菌科、芽單胞菌科、鞘脂單胞菌科的菌類豐度有所降低，600 倍稀釋印楝素處理組的各α 多樣性指數(shù)略低于300 倍稀釋處理組。這表明施用印楝素對薄殼山核桃林土壤細菌多樣性和豐度造成了一定影響，高濃度的印楝素對深層土壤的影響更高。

該薄殼山核桃林地深層土壤（50～55 cm）真菌豐度較低，未能成功擴增，因此僅針對不同施藥處理薄殼山核桃淺層土壤（10～15 cm）樣品和中層土壤（30～35 cm）進行了ITS 高通量測序分析。研究發(fā)現(xiàn)，所有土壤樣品中可識別真菌主要分屬于子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門，其中子囊菌門和擔子菌門為山核桃林地土壤中最優(yōu)勢菌門，施300 倍稀釋印楝素藥液樣品的擔子菌門真菌所占比例下降明顯，而未歸類真菌比例增高。兩種不同土壤深度樣品中，施藥組的絲蓋傘科和發(fā)菌科的菌類豐度均有所降低，施300 倍稀釋印楝素的中層土壤（30～35 cm）中孢菌科和扁孔腔菌科的菌類豐度偏低，600 倍稀釋印楝素處理組的球蓋菇科、間座殼科、毛殼菌科和紅菇科的菌類豐度在不同土層中出現(xiàn)一定程度的升高。施用印楝素對土壤樣品真菌α 多樣性指數(shù)影響較大，從趨勢上看，中層土壤真菌α 多樣性指數(shù)受施藥影響更明顯。

試驗結(jié)果表明，印楝素對薄殼山核桃林地土壤微生物產(chǎn)生了一定影響，其中高濃度的印楝素對土壤中擔子菌門真菌以及深層土壤微生物的影響較為顯著，十分不利于土壤微生物的多樣性，繼而影響植物的生長發(fā)育。因此，在生產(chǎn)實踐中需要研究藥液中印楝素適宜的濃度進行害蟲防治，降低對土壤微生物的影響，才能有利于薄殼山核桃林的長遠發(fā)展。本試驗僅對施用印楝素30 d 的薄殼山核桃林土壤真菌、細菌進行測序研究，對于印楝素對土壤微生物的長遠影響以及相同殺蟲效果下印楝素與化學農(nóng)藥對土壤微生物影響的對比，還需要進一步研究。