PCV2疫苗和免疫接種的10年：凈化能否成為事實(shí)(續(xù)1)

劉國(guó)民 宋慶慶 林文耀

摘? 要：在豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）出現(xiàn)后的20多年，它仍然是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)有重要經(jīng)濟(jì)影響的病原體。PCV2的商用疫苗在2006年首次進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)，在減少感染豬的臨床癥狀和提高產(chǎn)量方面起到了顯著的作用。最近的研究表明，PCV2在豬場(chǎng)豬群中的流行性和敗血癥發(fā)生率有所下降。然而，新變異毒株的出現(xiàn)又使PCV2的流行性上升。本文將評(píng)論P(yáng)CV2疫苗領(lǐng)域最新熱點(diǎn)的話題，包括比較商用疫苗的免疫效果、現(xiàn)有疫苗對(duì)新型毒株的免疫效力、自然感染和接種疫苗在免疫力上的差異、目前PCV2疫苗研究模型的局限性以及新穎試驗(yàn)疫苗的研究新進(jìn)展。討論也是在未來(lái)PCV2可得到凈化的前提下進(jìn)行的。

關(guān)鍵詞：PCV2疫苗;免疫接種;凈化

中圖分類號(hào)：S854.5+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2019）10-0059-04

3? PCV2疫苗對(duì)PCV2新型毒株的免疫效力

盡管豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）疫苗能有效減少豬圓環(huán)病毒2型相關(guān)疾?。≒orcine Circovirus 2 Associated Diseases，PCVAD）的臨床癥狀，但是定期出現(xiàn)的新的PCV2毒株或PCV2毒株的變異毒株——其中一些毒株具有更強(qiáng)的毒力——又重新引發(fā)了人們對(duì)PCV2疫苗是否需要進(jìn)行相應(yīng)的更新以能夠應(yīng)對(duì)新毒株以及PCV2疫苗在田間是否正在產(chǎn)生選擇性壓力的爭(zhēng)論。Ssemadaali等（2015）詳細(xì)闡述了支持這一爭(zhēng)論的數(shù)據(jù)，這種現(xiàn)象并不是第一次出現(xiàn)。例如，犬細(xì)小病毒疫苗能夠有效預(yù)防犬細(xì)小病毒病，但在采用該疫苗后流行毒株會(huì)定期更新。同樣，雞馬立克氏病疫苗被認(rèn)為是“漏洞疫苗（leaky-vaccines）”，因?yàn)樗軌蚍乐辜仪莩霈F(xiàn)臨床癥狀，但不能防止病毒的傳播，因此會(huì)影響未被列入疫苗構(gòu)想中的異種毒株的進(jìn)化。

自PCV2在美國(guó)的豬群中流行以來(lái)，PCV2的流行株已經(jīng)發(fā)生了在兩種亞型毒株之間的轉(zhuǎn)換，第一次轉(zhuǎn)換時(shí)主要的流行毒株P(guān)CV2b于2005—2006年出現(xiàn)（Cheung等， 2007），并代替了PCV2a毒株（Reiner等， 2015; Shen等， 2012）;近年來(lái)，PCV2d毒株出現(xiàn)并在豬群中迅速流行（Xiao等， 2015），該毒株的衣殼蛋白額外增加了一個(gè)氨基酸（Guo等， 2010）。由于PCV2的所有商用疫苗都針對(duì)PCV2a亞型毒株，研究人員隨后對(duì)新出現(xiàn)的毒株進(jìn)行了試驗(yàn)性研究，以評(píng)估它的致病性以及當(dāng)前疫苗對(duì)該毒株的免疫效力。豬在接種疫苗后病理學(xué)損傷評(píng)分下降，病毒血癥減弱，同時(shí)體內(nèi)中和抗體水平提高，由此被認(rèn)為免疫產(chǎn)生了保護(hù)作用。

大多數(shù)研究表明，PCV2疫苗可以減輕由PCV2異種毒株感染引起的臨床癥狀，并且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體反應(yīng)。然而，疫苗在減輕異種毒株引發(fā)的病毒血癥上各不相同，病毒血癥是田間試驗(yàn)所面臨的最重要的挑戰(zhàn)。例如，感染PCV2b的豬接種PCV2a疫苗免疫后，PCV2b引發(fā)的病毒血癥會(huì)明顯減輕，并且在接種后（Days Post-Challenge，DPC）約100 d，攻毒株會(huì)被清除干凈。但是，利用最能夠反應(yīng)田間情況的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并以PCV2 PCR陽(yáng)性豬為試驗(yàn)對(duì)象，結(jié)果顯示PCV2a疫苗并不能夠降低由已感染病毒所引起的病毒血癥，但是能夠減輕隨后由PCV2b、豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Disease Syndrome Virus，PRRSV）混合感染引起的病毒血癥。實(shí)驗(yàn)室研究表明，最新的PCV1-2b疫苗能夠完全清除同源PCV2b和異源PCV2a的攻毒毒株。然而，同樣在模擬田間條件（包括多重攻毒模型）的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中，PCV1-2b疫苗比PCV1-2a疫苗對(duì)預(yù)防PCV2b感染更有效。

在PCV2d分別于2010年和2012年出現(xiàn)于中國(guó)和美國(guó)的豬群中后，據(jù)估計(jì)，目前美國(guó)約有37%的豬群為PCV2d陽(yáng)性，這一數(shù)字強(qiáng)有力地證明了流行的PCV2正在不斷轉(zhuǎn)變基因型。與PCV2b相似，有關(guān)PCV2d的毒性是否更強(qiáng)的試驗(yàn)報(bào)告也是相互矛盾的。在一項(xiàng)研究中，Opriessnig等（2014b）利用從豬組織勻漿中分離到的非典型的PCV2和PRRSV的攻毒接種體比較了試驗(yàn)用PCV2d疫苗和商用PCV2a疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒的豬出現(xiàn)了嚴(yán)重的死亡，但存活的豬未表現(xiàn)出PCVAD癥狀。當(dāng)自然感染PCV2b的豬用3種商用PCV2a疫苗免疫后再用PCV2d攻毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染豬的PCV2b病毒血癥和PCV2d病毒血癥都得到了減輕，但是攻毒前并沒(méi)有減輕。同樣，免疫豬的損傷評(píng)分值也顯著降低。類似的，對(duì)自然感染PCV2b和PCV2d的豬群接種商用PCV2a疫苗，感染豬的PCV2d病毒血癥減輕，同時(shí)PCV2b病毒血癥完全消失。Jeong等（2015）指出，與未免疫的豬相比，免疫豬的損傷評(píng)分值下降，平均日增重（Average Day Gain，ADG）得到提高（表1）。有趣的是，在田間試驗(yàn)中，雖然平均日增重是評(píng)估疫苗免疫效果的最重要的指標(biāo)，但是由于該試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間短和環(huán)境更可控，試驗(yàn)性研究所得到的數(shù)據(jù)在推斷田間情況上幾乎沒(méi)有價(jià)值。

在最近一項(xiàng)評(píng)估PCV2流行情況的研究中，研究人員對(duì)73家豬場(chǎng)的1 097頭育肥豬（2012）和27家豬場(chǎng)的407頭母豬采集了血清樣本并進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)育肥豬和豬場(chǎng)豬群的PCV2病毒血癥分別為17%和52%，而2006年相應(yīng)的PCV2病毒血癥檢測(cè)結(jié)果分別為83%和99%。這些數(shù)據(jù)表明隨著時(shí)間的推移當(dāng)前的PCV2免疫接種方案可以根除豬群中的PCV2。然而，該研究并未檢測(cè)豬群中的PCV2d流行情況（Dvorak 等，2016），并且與Shen等（2012）的發(fā)現(xiàn)相反，豬場(chǎng)接種PCV2a疫苗的豬有較高的PCV2b病毒感染量，并且PCV2b的流行率高于PCV2a的;此外，對(duì)出現(xiàn)PCVAD臨床癥狀的豬進(jìn)行組織樣本PCR檢測(cè)，結(jié)果呈PCV2b陽(yáng)性或PCV2a陽(yáng)性的組織分別為65%和13%，表明PCV2b是導(dǎo)致豬免疫后出現(xiàn)臨床癥狀的原因。此外，豬場(chǎng)的PCV2b流行性（Shen等，2012）和不斷提高的PCV2d流行性（Xiao等，2015）不能夠反映出病毒血癥完全降低的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。然而，疾病的發(fā)病率并沒(méi)有達(dá)到PCV2新毒株出現(xiàn)時(shí)疫苗接種前的水平（圖1）。因此，簡(jiǎn)直可以說(shuō)由接種PCV2a疫苗或感染PCV2a所誘發(fā)產(chǎn)生的交叉保護(hù)的基本水平能夠?qū)⑿滦投局甑挠绊憸p到最少。當(dāng)現(xiàn)有的PCV2疫苗非常有效時(shí)，豬場(chǎng)所面臨的最大挑戰(zhàn)是豬群出現(xiàn)了高水平的病毒血癥，這會(huì)影響新的毒株或重組后變異的毒株的出現(xiàn)，以及在有協(xié)同感染因子時(shí)會(huì)影響動(dòng)物的健康。Chae（2016）綜述了PCV2疫苗會(huì)影響引發(fā)呼吸道疾病綜合征的其他病原體。研究協(xié)同感染以及免疫接種中致病因子相互作用是在預(yù)防PCV2上取得進(jìn)展的關(guān)鍵。

4? 評(píng)估PCV2疫苗效力的動(dòng)物模型

盡管在PCV2被發(fā)現(xiàn)后的18年中科研人員在預(yù)防豬感染PCV2上的取得了顯著進(jìn)展，但是第一次成功復(fù)制仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-Weaning Multi-Systemic Wasting Syndrome，PMWS）是由于培養(yǎng)物中未知有豬細(xì)小病毒存在的情況下實(shí)現(xiàn)的。盡管PMWS的臨床癥狀在協(xié)同感染模型中非常明顯，但是直到最近，PCV2疫苗的大多數(shù)研究都是在單獨(dú)用PCV2攻毒時(shí)進(jìn)行的。缺乏能夠準(zhǔn)確復(fù)制PCVAD全部癥狀的模型仍然是實(shí)驗(yàn)室評(píng)估PCV2疫苗免疫效果上的主要屏障，并且要對(duì)就PCV2病毒血癥或PCV2毒力進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室研究和田間觀察之間通常觀察到的不一致結(jié)果負(fù)一定的責(zé)任。

許多因素，包括一些未充分描述特征的因素，都會(huì)影響PCVAD的癥狀，進(jìn)而會(huì)影響疫苗在實(shí)驗(yàn)室和田間進(jìn)行的效力評(píng)估結(jié)果。一些田間變量很難在實(shí)驗(yàn)室條件下被復(fù)制，所有的努力都旨在改善現(xiàn)有的動(dòng)物模型。在調(diào)查研究PCVAD的過(guò)程中，豬的品種和遺傳背景的差異都被認(rèn)為會(huì)在一定程度上影響動(dòng)物對(duì)PCV2的敏感性。品種信息經(jīng)常會(huì)從實(shí)驗(yàn)室的疫苗研究出版物中漏掉。環(huán)境條件，即溫度和飼養(yǎng)密度，同樣會(huì)對(duì)PCVAD的發(fā)展產(chǎn)生顯著影響，并且在可以對(duì)不同研究進(jìn)行邏輯比較前可以保證不同研究之間的標(biāo)準(zhǔn)化。隨著我們對(duì)PCVAD的認(rèn)識(shí)不斷增加，改進(jìn)現(xiàn)有的動(dòng)物模型將會(huì)縮短實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果和田間數(shù)據(jù)之間的差距，并且會(huì)對(duì)PCVAD復(fù)雜的發(fā)病機(jī)理和涉及的協(xié)同病原體的相互作用有更全面的認(rèn)識(shí)。

5? PCV2疫苗介導(dǎo)的免疫

盡管PCV2疫苗的臨床效力非常高，但是其保護(hù)機(jī)制尚不清楚。宿主對(duì)PCV2的免疫反應(yīng)之前已經(jīng)被廣泛討論過(guò)，中和抗體和細(xì)胞免疫（CMI）在宿主免疫應(yīng)答中都起到重要的作用。臨床得病仔豬和亞臨床感染豬之間的主要免疫學(xué)差距是中和抗體產(chǎn)生的時(shí)間延遲或低水平表達(dá)，出現(xiàn)臨床癥狀的豬會(huì)出現(xiàn)高水平的IL-10和低水平的IFN-γ應(yīng)答。了解這一發(fā)現(xiàn)的免疫學(xué)機(jī)制和分子機(jī)制對(duì)疫苗的任何合理設(shè)計(jì)都至關(guān)重要。

最近關(guān)于PCV2抗體反應(yīng)的研究已經(jīng)證實(shí)衣殼蛋白的169～180號(hào)殘留堿基位于一個(gè)可能的抗原表位上。細(xì)菌性表達(dá)單體所形成的蛋白免疫會(huì)針對(duì)169～180片段誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平抗體和低水平的中和反應(yīng)，而用在商品苗中桿狀病毒表達(dá)的蛋白免疫則不會(huì)出現(xiàn)上述情況;這表明蛋白的構(gòu)象在抗體反應(yīng)中起著重要的作用。因此可以推斷，在自然感染和免疫接種中，衣殼蛋白的蛋白水解過(guò)程的不同會(huì)針對(duì)抗原表位產(chǎn)生高水平的抗體，而在疫苗的病毒樣顆粒中抗原表位會(huì)隱藏?？梢钥隙ǖ氖牵F(xiàn)有的PCV2a疫苗和新出現(xiàn)的PCV2毒株之間會(huì)產(chǎn)生顯著的交叉保護(hù)。

據(jù)觀察，PCV2感染豬在沒(méi)有強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)時(shí)不會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀，因此可以假設(shè)細(xì)胞免疫在免疫應(yīng)答中起重要的作用但是可以被替代，并且在免疫豬和感染豬中細(xì)胞免疫有所不同。對(duì)有PMWS癥狀的免疫豬和感染豬進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，感染動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生有效的天然免疫，并且IL-10表達(dá)水平高，而免疫豬IFN-γ、IL-8、TNF-α和IL-1b的表達(dá)水平高。對(duì)IL-10高水平和細(xì)胞免疫的解釋為，在PCV2感染豬中程序化的死亡結(jié)構(gòu)域（程序性死亡-配體1和程序性死亡-配體2）會(huì)上調(diào)，可能會(huì)使細(xì)胞免疫減弱以及免疫抑制。衣殼蛋白而非復(fù)制酶或開放閱讀框是IL-10上調(diào)的主要原因。PCV2在豬胎兒胸腺中被發(fā)現(xiàn)要先于成熟的T細(xì)胞應(yīng)答，并且通過(guò)消除高親和力的克隆來(lái)異常調(diào)節(jié)T細(xì)胞成熟。這可能是因?yàn)镻CV2衣殼被認(rèn)為是自身抗原，因此可以減少抗病毒反應(yīng)的強(qiáng)度。

6? 新型PCV2疫苗的優(yōu)勢(shì)

隨著PCV2疫苗在提高經(jīng)濟(jì)效益和減少臨床癥狀上的成功，近年來(lái)對(duì)提升PCV2疫苗的努力聚焦在：a）提高免疫原性和疫苗有效性;b）提高不同PCV2病毒或其他協(xié)同感染病原的覆蓋率;c）開發(fā)可區(qū)分感染豬和免疫豬（Differentiation of Infected and Vaccinated Animals，DIVA）的疫苗。

在改善疫苗覆蓋率的新方法中，PCV2和PCV1基因組框架被用來(lái)表達(dá)外源表位來(lái)開發(fā)雙重、活的疫苗。例如在PCV1衣殼蛋白C段或嵌合PCV1-2感染克隆中表達(dá)PRRSV的保護(hù)表位，或者在PCV2中表達(dá)口蹄疫保護(hù)表位。隨著PCV2b代替PCV2a成為美國(guó)的流行毒株，PCV2b疫苗變?yōu)榍逗螾CV1-2b疫苗，即在PCV1的骨架中用PCV2b的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）2代替PCV1的ORF2。在實(shí)驗(yàn)室研究中，新疫苗對(duì)同源和不同源的PCV2毒株均有效。為了處理豬鏈球菌病發(fā)病率的增加，一種豬痘病毒載體被用來(lái)表達(dá)豬鏈球菌的類M蛋白、PCV2的ORF2和豬IL-8，能夠成功誘導(dǎo)兩種豬病的免疫反應(yīng)。其他方法包括PCV2 ORF2在細(xì)菌鞭毛蛋白中的融合表達(dá)，可以同時(shí)提高Th1和Th2的應(yīng)答，并在DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒中與CpG或豬IL-8基因合并，從而提高Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

隨著PCV2疫苗的成功，全美范圍內(nèi)的根除計(jì)劃要求DIVA可用疫苗有實(shí)用性。之前已經(jīng)提到在感染克隆中將標(biāo)簽插入到PCV2 ORF2的C段能夠成功表達(dá)。此外針對(duì)非結(jié)構(gòu)的ORF1蛋白來(lái)檢測(cè)抗體反應(yīng)，只在活病毒能夠復(fù)制的動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)，由此可以區(qū)分PCV2感染和免疫動(dòng)物。

能夠與DIVA性能結(jié)合的可以誘導(dǎo)高水平保護(hù)的疫苗，可以進(jìn)一步降低感染豬的病毒血癥，或者誘導(dǎo)產(chǎn)生消除性免疫，從而有能力解決慢性亞臨床PCV2感染的水平。

7? PCV2根除前景

在目前來(lái)看，考慮到PCV2的疫苗效力和積極的免疫實(shí)踐，最終PCV2根除的前景會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。盡管臨床癥狀可以通過(guò)疫苗得到控制，田間面臨的最大問(wèn)題是與自然流行毒株亞臨床協(xié)同感染的發(fā)生，這會(huì)加劇協(xié)同感染，減少?gòu)V泛的免疫應(yīng)答和抗病性。在積極使用PCV2疫苗的國(guó)家，PCV2的流行會(huì)隨著疫苗使用大幅度下降。同時(shí)一系列新的變異會(huì)在同一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)。一項(xiàng)在豬群中使用單苗判斷是否能夠有效根除PCV2的研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)使用疫苗會(huì)使PCV2降低到不可察覺(jué)的水平，但是當(dāng)疫苗停用后病毒會(huì)在短期內(nèi)重新出現(xiàn)。因此關(guān)于單獨(dú)使用強(qiáng)制疫苗是否會(huì)有效根除PCV2的數(shù)據(jù)是自相矛盾的。盡管PCV2疫苗對(duì)于預(yù)防病毒感染是很有效的，但是目前不適合治療，因此想用現(xiàn)有疫苗在全美范圍內(nèi)根除PCV2是不可取的。合理設(shè)計(jì)抗PCV2感染的疫苗以及合理了解PCV2疫苗可能實(shí)現(xiàn)高水平的免疫效力和廣泛的保護(hù)力。

其次，更符合習(xí)俗的根除方法是建造無(wú)疫區(qū)，在該區(qū)域內(nèi)豬無(wú)PCV2，被強(qiáng)制免疫，并引入生物安全性的測(cè)量方法，之后逐漸推廣到全美。隨著PCV2發(fā)生率的降低，尋找無(wú)PCV2感染豬用作后備豬是很有可能的。盡管如此，實(shí)施這一過(guò)程中需要篩選被感染豬，這就需要找到實(shí)用的DIVA疫苗和相關(guān)的ELISA方法。想要通過(guò)單獨(dú)使用疫苗實(shí)現(xiàn)PCV2的凈化還需要更加協(xié)調(diào)、有計(jì)劃性以及更多的經(jīng)費(fèi)。PCV2的凈化在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)將會(huì)在成本和動(dòng)物健康方面帶來(lái)直接和間接的益處。

（續(xù)完）

原題名：Ten years of PCV2 vaccines and vaccination： is eradication a possibility？（英文）

原作者：Zahra Afghaha、Brett Webbb、Xiang-Jin Mengc和Sheela Ramamoorthy（美國(guó)）