種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與種植體周圍炎的關(guān)系

許東亮， 彭朝暉， 劉濤△

1河南省人民醫(yī)院、鄭州大學(xué)人民醫(yī)院、河南大學(xué)人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心(河南鄭州 450003); 2中國(guó)平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院口腔科(河南平頂山 467000)

種植體周圍炎是由于口腔細(xì)菌微生物引發(fā)的種植體周圍硬軟組織的炎癥，臨床表現(xiàn)為探針出血、黏膜紅腫、溢膿等，若治療不及時(shí)，最終可能導(dǎo)致種植體松動(dòng)脫落[1]。目前治療種植體周圍炎的方法是牙周基礎(chǔ)治療結(jié)合抗生素的使用，然而，種植體周圍炎疾病進(jìn)展迅速，致炎因子引起的破骨細(xì)胞活化易導(dǎo)致牙槽骨吸收平衡遭到破壞，傳統(tǒng)治療方式對(duì)改善或逆轉(zhuǎn)牙槽骨吸收效果不明顯[2]。因此，在種植體周圍炎癥初期抑制破骨細(xì)胞活化，維持牙槽骨吸收與新生的平衡，對(duì)臨床治療種植體周圍炎具有十分重要的意義。然而種植體周圍炎與種植體齦溝液中生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系仍有待進(jìn)一步探究，研究表明，miR-23a在慢性炎癥反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)，與肝炎、牙周炎等炎性疾病有關(guān)[3]。miR-146a是炎癥因子信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，可能是導(dǎo)致牙周炎等慢性炎性疾病進(jìn)展的重要因素[4]。但miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎的關(guān)系，目前尚鮮有報(bào)道，基于此，本研究通過(guò)檢測(cè)種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a的水平，以期探討兩者與種植體周圍炎的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年6月至2017年12月于本院行牙種植修復(fù)，并進(jìn)行術(shù)后12個(gè)月復(fù)查的189例患者為研究對(duì)象，其中男100例，女89例，年齡25～75歲，平均(49.15±16.70)歲，種植體265枚。根據(jù)臨床指標(biāo)將患者分為：健康種植體組[探針深度(PD)≤3 mm，齦溝出血指數(shù)(SBI)≤2 ] 87例，其中男47例，女40例，年齡26～75歲，平均(49.91±16.70)歲，種植體109枚，炎癥種植體組(PD>3 mm，SBI>2)102例，其中男53例，女49例，年齡26～73歲，平均(47.85±16.83)歲，種植體156枚。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)口腔衛(wèi)生良好，首次進(jìn)行種植牙修復(fù)術(shù)；(2)患者自愿配合本次研究，資料獲取完整；(3)患者均已簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有慢性咽炎、扁桃體炎等相關(guān)炎癥疾病；(2)妊娠期、哺乳期婦女；(3)近期使用過(guò)抗生素、免疫制劑等藥物；(4)伴有全身系系統(tǒng)性疾病患者。

同期選取在本院參與體檢者78例作為對(duì)照組，男40例，女38例，年齡25～75歲，平均(50.12±16.35)歲，3組受試者性別、年齡等一般資料相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 齦溝液的采集 清水漱口，用無(wú)菌干棉球擦干牙面，隔濕進(jìn)行取樣，探針去除菌斑，氣槍輕吹牙齦，將濾紙條(2 mm×20 mm)插入齦下約60 s，取出濾紙條，測(cè)量并記錄浸濕長(zhǎng)度，并將浸濕部分剪入裝有100 μL生理鹽水的EP管中，每管含2條濾紙(同一樣本)，振蕩1 h，在4℃離心機(jī)(1 000 r/min)上離心10 min，取上清液，置于-70℃冰箱中保存待測(cè)。

1.2.2 齦溝液的定量 用微量加樣槍依次取人血清0.1～1.5 μL，分別滴在與1.2.1齦溝液采集同種規(guī)格的濾紙上，測(cè)量濾紙條浸濕長(zhǎng)度，繪制濾紙條浸潤(rùn)長(zhǎng)度與血清量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=0.010 24+0.148 31X，R2=0.997 7，P=0.000)，計(jì)算齦溝液量(gingival cervical fluid，GCF)。

1.2.3 臨床指標(biāo)測(cè)定 (1)PD：用牙簽探針檢查牙種植修復(fù)患者及正常人牙的近側(cè)、遠(yuǎn)中頰側(cè)，近中、遠(yuǎn)中舌側(cè)，4個(gè)位點(diǎn)的PD，記錄數(shù)據(jù)，并求取平均值。(2)檢查并記錄牙種植修復(fù)患者及正常人SBI，SBI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0：牙齦健康不出血，1：牙齦輕度炎癥，2：牙齦輕度炎癥，探診后點(diǎn)狀出血，3：牙齦中度炎癥，探診后血溢在齦溝內(nèi)，4：牙齦重度炎癥，探診后血溢出齦溝，5：探診后牙齦出血或自動(dòng)出血。

1.2.4 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法檢測(cè)齦溝液中miR-23a、miR-146a水平，取齦溝液上清待測(cè)樣品，室溫解凍，采用miRNA提取試劑盒提取樣品總miRNA，采用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR定量檢測(cè)血清中miR-23a、miR-146a水平，實(shí)驗(yàn)過(guò)程參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書，miRNA提取試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)自上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司，miScript SYBR Green PCR Kit購(gòu)自上海力敏實(shí)業(yè)有限公司。反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：95℃：15 s；95℃：50 s；60℃：15 s，共40個(gè)循環(huán)。每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

miR-23a、miR-146a及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCT法分析miR-23a、miR-146a的進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 3組受試者癥狀指標(biāo)比較 炎癥種植體組PD、GCF、SBI均顯著高于對(duì)照組和健康種植體組(P<0.05)，健康種植體組PD、GCF、SBI與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

項(xiàng)目例數(shù)PD(mm)GCF(μL)SBI對(duì)照組782.53±0.450.70±0.240.65±0.23健康種植體組852.59±0.480.85±0.260.78±0.29炎癥種植體組1024.26±1.02?△1.91±0.60?△3.25±1.04?△F值169.509229.112438.533P值0.0000.0000.000

*與對(duì)照組比較P<0.05； △與健康種植體組比較P<0.05

2.2 3組受試者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平比較 炎癥種植體組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于對(duì)照組和健康種植體組(P<0.05)，健康種植體組患者齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

項(xiàng)目例數(shù)miR-23a/U6miR-146a/U6對(duì)照組781.02±0.291.04±0.32健康種植體組851.88±0.56?2.21±0.75?炎癥種植體組1022.95±0.92?△3.87±1.17?△F值136.832181.214P值0.0000.000

*與對(duì)照組比較P<0.05；△與健康種植體組比較P<0.05

2.3 不同性別種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平比較 不同性別患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

>60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于<40歲組和40～60歲組(P<0.05)，40～60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與<40歲組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

項(xiàng)目例數(shù)miR-23a/U6miR-146a/U6男性532.92±0.863.81±1.07女性492.98±0.813.94±1.13t值0.3620.597P值0.7180.552

項(xiàng)目例數(shù)miR-23a/U6miR-146a/U6<40歲122.79±0.373.59±0.4540～60歲462.86±0.403.70±0.55>60歲443.10±0.49?△4.10±0.78?△F值4.3365.406P值0.0160.006

*與≤40歲組比較P<0.05；△與40～60歲組比較P<0.05

2.5 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性 齦溝液中miR-23a水平均與患者PD、SBI呈正相關(guān)(P<0.05)，齦溝液中miR-146a水平均與患者PD、SBI呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

種植體周圍炎是由多種因素引起的可逆炎癥反應(yīng)，據(jù)臨床調(diào)查顯示，種植體周圍炎的發(fā)病率約為10%[5]，若治療不及時(shí)，則可能使種植體周圍支持組織喪失，形成種植體周圍袋，最終導(dǎo)致種植體脫落，種植術(shù)失敗[6]。其中引起種植體周圍炎的風(fēng)險(xiǎn)因素主要有三類：菌斑、宿主因素(牙周炎、糖尿病、吸煙)、醫(yī)源性因素(置入位置不佳、邊緣不密合)[7]。因此有效規(guī)避引起種植體周圍炎的危險(xiǎn)因素，深入探究種植體齦溝液中相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)與種植體周圍炎臨床指標(biāo)的關(guān)系，對(duì)提高種植體的成功率十分重要。

PD指牙周袋的深度，是重要的牙周臨床指標(biāo)之一，在炎癥牙齦PD值通常高于健康牙齦，主要是因?yàn)闇y(cè)量時(shí)探針可穿透結(jié)合上皮，進(jìn)入炎癥結(jié)締組織內(nèi)，而健康牙齦探針尖端則終止于結(jié)合上皮。GCF是指通過(guò)溝內(nèi)、結(jié)合上皮從牙齦結(jié)締組織滲入到齦溝內(nèi)的液體，一般情況下齦溝液流出量與牙周炎癥程度成正比。SBI能夠反映出牙齦炎癥活動(dòng)期的狀況，是常見(jiàn)的牙周炎癥臨床指標(biāo)。謝謙等[8]研究表明PD、GCF、SBI均高于對(duì)照組和健康種植體組，本研究與謝謙等的研究結(jié)果一致，結(jié)果顯示，炎癥種植體組PD、GCF、SBI顯著高于對(duì)照組和健康種植體組，提示PD、GCF、SBI作為常見(jiàn)的牙周炎癥臨床指標(biāo)能夠反映種植體周圍炎活動(dòng)狀況及炎癥程度。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類非編碼的小分子RNA，長(zhǎng)約22 nt，在各種生物體內(nèi)表達(dá)廣泛，能夠參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖與凋亡等生命過(guò)程，且在腫瘤疾病、內(nèi)分泌疾病及炎癥疾病中表達(dá)異常[9]。miR-23包括2種亞型，miR-23a與miR-23b，其中miR-23a具有廣泛的基因調(diào)節(jié)功能[10]。李杰等[11]研究表明miR-23a在肺癌患者血清中表達(dá)上調(diào)。楊博等[12]研究表明miR-23a在炎癥性牙齦和牙槽骨組織中表達(dá)上調(diào)可能調(diào)節(jié)具有調(diào)節(jié)炎性微環(huán)境中骨組織的代謝及調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞生物學(xué)特性的作用。本研究結(jié)果顯示炎癥種植體組患者齦溝液中miR-23a水平顯著高于對(duì)照組和健康種植體組，健康種植體組患者齦溝液中miR-23a水平顯著高于對(duì)照組，提示炎癥種植體患者種植體齦溝液中miR-23a表達(dá)上調(diào)，miR-23a可能種植體周圍炎的發(fā)生有關(guān)。

miR-146包括2個(gè)亞型，即miR-146a與miR-146b，其中miR-146a可參與炎癥因子信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，具有調(diào)控免疫細(xì)胞分化及免疫功能的作用[13]。研究表明miR-146a在炎性組織中表達(dá)上調(diào)，與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程有關(guān)[14]。賀學(xué)農(nóng)等[15]研究表明大鼠輕型腦創(chuàng)傷后，大鼠腦皮質(zhì)中miR-146a表達(dá)顯著上調(diào)，在促進(jìn)腦創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示，炎癥種植體組患者齦溝液中miR-146a水平顯著高于對(duì)照組和健康種植體組，健康種植體組患者齦溝液中miR-146a水平顯著高于對(duì)照組，提示miR-146a可能與種植體炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

酈興[16]研究表明種植體周圍炎齦溝液中炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6及γ干擾素(IFN-γ)表達(dá)水平與種植體周圍炎患者性別無(wú)關(guān)，但與患者年齡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，不同性別患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不同年齡段中，>60歲組患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平顯著高于<40歲組及40～60歲組人群，提示患者種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與性別無(wú)關(guān)，但可能與患者年齡有關(guān)，分析造成此類現(xiàn)象的主要原因有：老年人免疫功能減退，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)于炎性因子的清除較弱，因此可能存在miR-23a、miR-146a水平較高的現(xiàn)象。本研究通過(guò)pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示齦溝液中miR-23a、miR-146a水平均與患者PD、SBI呈正相關(guān)，提示齦溝液中miR-23a、miR-146a水平與種植體周圍炎患者牙周組織損傷的程度有關(guān)，可能反映種植體周圍組織的健康狀態(tài)。

綜上所述，在種植體周圍齦溝液中miR-23a、miR-146a表達(dá)上調(diào)，兩者與種植體周圍炎相關(guān)臨床指標(biāo)有關(guān)，可能成為反映早期種植體周圍炎癥進(jìn)展及牙周組織損傷程度的生物標(biāo)志物。然而本研究樣本例數(shù)較少，下一步準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本容量，繼續(xù)進(jìn)行miR-23a、miR-146a與種植體周圍炎相關(guān)生物學(xué)機(jī)制等的研究。