外源性催產(chǎn)素在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的鎮(zhèn)痛作用研究

羅雅范，韓毅，邸暢，李國萍，陳紹春，5*

本研究價值：

本研究證明了外源性催產(chǎn)素能有效緩解大鼠的炎癥性疼痛，降低外周血和炎性組織中前列腺素E2水平，并初步揭示了外源性催產(chǎn)素可能通過抗炎和減少致痛因子而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，為臨床鎮(zhèn)痛治療提供了新的思路。但對慢性疼痛的鎮(zhèn)痛效果及長期反復(fù)使用催產(chǎn)素的潛在負(fù)面效應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。

疼痛是一種令人不愉快的感覺以及情緒上的感受，伴或不伴有實質(zhì)上或潛在的組織損傷。各種損傷刺激通過感覺神經(jīng)纖維傳入脊髓，最后到達(dá)大腦皮質(zhì)感覺區(qū)而引起疼痛，是一種多維度體驗（包括情感、認(rèn)知等多方面），嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。炎性疼痛主要由組織損傷后釋放的炎性因子（同時也是致痛因子）引起，這些致痛因子是疼痛的主要病理基礎(chǔ)。致痛因子主要由巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等釋放，包括促炎因子、前列腺素類（PG）、緩激肽（BRK）等，其中前列腺素E2（PGE2）是這些遞質(zhì)中最重要的致痛因子之一［1］。

催產(chǎn)素主要是由下丘腦視上核和室旁核的神經(jīng)元合成的一種垂體肽類激素，除了具有使妊娠末期子宮收縮和促進(jìn)哺乳期排乳的作用外，其在鎮(zhèn)痛方面的作用正日益引起人們的關(guān)注［2］。催產(chǎn)素受體屬于G蛋白耦聯(lián)受體，在催產(chǎn)素與受體結(jié)合后，可以激活蛋白激酶C（PKC）、磷脂酶C（PLC）等系統(tǒng)，并通過升高內(nèi)源性Ca2+濃度等途徑產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)［3］。研究顯示，催產(chǎn)素具有神經(jīng)遞質(zhì)和激素的雙重作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）作為神經(jīng)遞質(zhì)參與大腦的重要功能，如社會行為、情感處理等［4］。催產(chǎn)素作為神經(jīng)激素主要通過腦垂體后葉的軸突終端釋放入血以到達(dá)全身各個系統(tǒng)，在血液循環(huán)中主要以自由肽的形式存在。MIRANDACARDENAS等［5］在大鼠中發(fā)現(xiàn)一個新的催產(chǎn)素能通路，這條通路起源于室旁核（PVN），投射到脊髓背角，該條神經(jīng)通路被證實在損傷性刺激中參與痛覺信息傳遞的調(diào)控。亦有研究證實催產(chǎn)素在CNS有鎮(zhèn)痛作用，包括在脊髓水平發(fā)揮抗痛覺過敏的作用［6］。雖然催產(chǎn)素已被證實有鎮(zhèn)痛作用，但多為分析其在CNS中的鎮(zhèn)痛作用，而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的鎮(zhèn)痛作用鮮有報道。且CHOW等［7］研究表明，人類腦脊液和血液中的催產(chǎn)素含量不相關(guān)，說明周圍神經(jīng)系統(tǒng)和CNS的催產(chǎn)素池是兩個獨立的部分，即催產(chǎn)素不能通過血-腦脊液屏障。

角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質(zhì)，可用于制備多種組織炎癥模型。角叉菜膠導(dǎo)致的大鼠足底腫脹模型是一個常用于評價或篩選藥物抗炎作用的經(jīng)典模型，當(dāng)給大鼠足掌內(nèi)注射少量角叉菜膠時能引起大鼠足部明顯疼痛，并伴有局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增高、滲出、水腫等一系列類似于人體急性炎癥的反應(yīng)［8］。因此，本研究擬通過采用角叉菜膠注入大鼠足掌構(gòu)建炎性疼痛模型，給予外源性催產(chǎn)素，通過熱板、壓板試驗檢測催產(chǎn)素的鎮(zhèn)痛效果，通過測量大鼠足掌腫脹程度檢測催產(chǎn)素的抗炎作用，并檢測周圍神經(jīng)系統(tǒng)致痛因子PGE2的變化情況，分析催產(chǎn)素在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛作用，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物、試劑和儀器 催產(chǎn)素（深圳市豪地華拓生物科技有限公司，中國），催產(chǎn)素ELISA試劑盒、PGE2 ELISA試劑盒（伊萊瑞特生物科技股份有限公司，中國），低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國），電熱三用超級熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司，中國），酶標(biāo)儀（Thermo，美國）。

1.2 實驗動物及分組 2017年3月—2018年1月，40只清潔級成年SD雄性大鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，體質(zhì)量180～220 g。將SD大鼠隨機(jī)分為5組（各8只）后進(jìn)行造模。（1）對照組（NOR組）：不進(jìn)行任何處理；（2）模型組（INF組）：右后足足掌部注射角叉菜膠0.1 ml/只；（3）安慰治療組（NS組）：右后足足掌部注射角叉菜膠0.1 ml/只，隨后即刻腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.5 ml/只；（4）催產(chǎn)素治療組（OT組）：右后足足掌部注射角叉菜膠0.1 ml/只，隨后即刻腹腔注射催產(chǎn)素0.5 ml/只（50 μg/kg）；（5）陽性對照組（ASP組）：右后足足掌部注射角叉菜膠0.1 ml/只，隨后即刻腹腔注射阿司匹林0.5 ml/只（250 mg/kg）。角叉菜膠注射順利、無溢出為造模成功。除NOR組外，其余4組均造模成功，無死亡及特殊損傷情況。

5組大鼠在造模4 h后進(jìn)行行為學(xué)檢測、腫脹程度檢測、采血等。

1.3 實驗方法

1.3.1 采用熱板實驗測量大鼠造模前后熱板潛伏時間（HPL） 熱板溫度保持在（52.0±0.1）℃，以HPL為其痛閾指標(biāo)，即大鼠右后足接觸熱板至其離開熱板的時間。

1.3.2 采用壓板試驗測量大鼠造模前后后足縮足潛伏期（HWL） 將大鼠右后足平放在壓板測量計上，使壓板測量計上可滑動的平鈍活塞剛好挨著大鼠右后足背側(cè)的皮膚（跗跖關(guān)節(jié)）處，再開始使用壓力測痛儀對大鼠進(jìn)行壓力測試，當(dāng)大鼠右后足從壓板上后撤時記為大鼠的HWL。

1.3.3 后足足周長及后足腫脹程度檢測 分組后先由同一人用棉繩測量大鼠右后足中部橫向周長，以足掌面中心處為中心繞其1周，作為基礎(chǔ)初始周長。當(dāng)各組造模4 h后，再按照相同的方法測量其周長。后足腫脹程度=（造模4 h后后足周長-初始后足周長）/初始后足周長 ×100%［9］。

1.3.4 采用ELISA法檢測外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平及炎性組織PGE2水平 10%水合氯醛麻醉后，采用摘眼球法采血，將血液收集于無熱源、無內(nèi)毒素的試管，隨即放入 4 ℃冰箱靜置 30 min，1 000 r/min 離心 15 min（離心半徑為7.2 cm），取上清液待測。取完血液樣本后，將大鼠右后足剪下，迅速將組織分離成適宜的小塊，按1∶9的體積加入預(yù)冷的勻漿緩沖液，冰浴下高速勻漿機(jī)勻漿，勻漿液 5 000 r/min離心 10 min（離心半徑為8.4 cm），取上清液待測。后續(xù)按照ELISA試劑盒操作流程進(jìn)行操作，檢測外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平及炎性組織PGE2水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用PRISM 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組 大 鼠HPL比較 5組大鼠造模前HPL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5組大鼠造模4 h后HPL比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。造模4 h后，INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠HPL均短于NOR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT組、ASP組大鼠HPL長于INF組、NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NS組大鼠HPL與INF組比較、OT組大鼠HPL與ASP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NOR組大鼠造模前后HPL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠造模4 h后HPL均短于本組造模前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組 大 鼠HWL比較 5組大鼠造模前HWL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5組大鼠造模4 h后HWL比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。造模4 h后，INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠HWL短于NOR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT組、ASP組大鼠HWL長于INF組、NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NS組大鼠HWL與INF組比較、OT組大鼠HWL與ASP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。NOR組大鼠HWL造模前后比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠造模4 h后HWL均短于本組造模前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表1 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠HPL比較（x± s，s，n=8）Table 1 Comparison of HPL among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

2.3 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠造模前后后足周長及后足腫脹程度比較 5組大鼠造模前后足周長比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；5組大鼠造模4 h后后足周長、后足腫脹程度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。造模4 h后，INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠后足周長長于NOR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT組、ASP組大鼠后足周長短于INF組、NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NS組大鼠后足周長與INF組比較、OT組大鼠后足周長與ASP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。OT組、ASP組大鼠后足腫脹程度小于INF組、NS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NS組大鼠后足腫脹程度與INF組比較、OT組大鼠后足腫脹程度與ASP組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

2.4 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平比較 5組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。INF組、NS組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平高于NOR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT組、ASP組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平與NOR組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；INF組與NS組、OT組與ASP組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表4）。

2.5 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠炎性組織PGE2水平比較 5組大鼠炎性組織PGE2水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。INF組、NS組大鼠炎性組織PGE2水平高于NOR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；OT組、ASP組大鼠炎性組織PGE2水平與NOR組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；INF組與NS組、OT組與ASP組大鼠炎性組織PGE2水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表5）。

3 討論

在鎮(zhèn)痛機(jī)制上，通常認(rèn)為非麻醉性鎮(zhèn)痛藥（如阿司匹林）主要作用于外周感受器，而麻醉性鎮(zhèn)痛藥（如嗎啡等）主要作用于CNS。軀體疼痛時，臨床醫(yī)生通常采用阿片或阿片類鎮(zhèn)痛藥，但這些藥物會產(chǎn)生嚴(yán)重的成癮性和依賴性。阿司匹林是常用的外周鎮(zhèn)痛藥，但胃腸道方面的不良反應(yīng)比較明顯。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽（如甘丙肽和降鈣素基因相關(guān)肽等）在中樞水平參與了對大鼠的鎮(zhèn)痛作用，而催產(chǎn)素也是一種小分子肽，并且是哺乳動物自然分泌的一種神經(jīng)肽，可以避免阿片類藥物的成癮性、阿司匹林的胃腸道反應(yīng)，所以研究催產(chǎn)素的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制具有十分重要的臨床意義［10］。

表2 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠HWL比較（x± s，s，n=8）Table 2 Comparison of HWL among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表3 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠造模前后后足周長及后足腫脹程度比較（x ±s，n=8）Table 3 Comparison of circumference and swelling degree of right hind paw berore and after treatment among NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表4 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠外周血血清催產(chǎn)素、PGE2水平比較（x±s，n=8，pg/ml）Table 4 Comparison of oxytocin and PGE2 levels in peripheral blood of NOR，INF，NS，OT and ASP groups

表 5 NOR組、INF組、NS組、OT組、ASP組大鼠炎性組織PGE2水平比較（x ±s，n=8，pg/ml）Table 5 Comparison of PGE2 levels in the inflammatory tissue of NOR，INF，NS，OT and ASP groups

研究表明，側(cè)腦室內(nèi)注射催產(chǎn)素會激活下丘腦內(nèi)室旁核或視上核的催產(chǎn)素受體，而下丘腦視上核與大腦內(nèi)參與鎮(zhèn)痛的核團(tuán)，如中縫大核、藍(lán)斑、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)以及脊髓背角等均有非常密切的關(guān)系［11］。痛刺激可以引起CNS內(nèi)許多部位催產(chǎn)素含量發(fā)生不同程度的變化，電針刺激雙側(cè)足三里后，脊髓內(nèi)催產(chǎn)素含量明顯增加，側(cè)腦室內(nèi)注射催產(chǎn)素也可緩解疼痛［12］。HAN等［13］研究表明，脊髓背角不僅有來自視上核和室旁核的催產(chǎn)素能神經(jīng)纖維末梢，也存在催產(chǎn)素能突觸的特殊結(jié)合位點。這些研究均說明催產(chǎn)素確實可在CNS參與疼痛調(diào)制而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

既往研究表明，周圍神經(jīng)系統(tǒng)和CNS的催產(chǎn)素池是兩個獨立的部分，催產(chǎn)素不能透過血-腦脊液屏障［14］，那么催產(chǎn)素是如何在周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用呢？本研究通過大鼠足掌部注射角叉菜膠構(gòu)建炎性疼痛模型，給予外源性催產(chǎn)素鎮(zhèn)痛，經(jīng)熱板實驗和壓板試驗檢測證實外源性催產(chǎn)素也具有明顯的鎮(zhèn)痛效果。

有研究認(rèn)為，炎性部位釋放的趨化因子可吸引白細(xì)胞的移動，而后者釋放的大量細(xì)胞因子，包括前列腺素類、緩激肽等，形成復(fù)雜的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致系統(tǒng)炎性反應(yīng)的發(fā)生［15］。炎癥表現(xiàn)包括紅、腫、熱、痛和功能障礙，其中腫脹是炎性部位的一種基本變化，并且是急性炎癥的標(biāo)志性變化之一，因此對腫脹的抑制程度也可以反映藥物的抗炎作用［16］。大量研究表明，細(xì)胞因子包括PGE2等在急性炎癥的發(fā)病過程中起到非常重要的作用，研究細(xì)胞炎性因子的水平變化可以作為評價并預(yù)測炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)，而血清或組織液中細(xì)胞炎性因子水平的變化可以在一定程度上反映藥物的治療效果［17］。PGE2受體激活可導(dǎo)致外周傷害感受器中PKC和PKA的活化，繼而激活多個分子，包括瞬態(tài)電壓感受器陽離子通道1（TRPV1）通道、嘌呤能P2X3受體、Ca2+通道，然后激活電壓門控鈉通道，導(dǎo)致炎性痛覺過敏［18］。本研究通過對大鼠足掌皮下注射1%角叉菜膠成功誘發(fā)了局部急性炎性疼痛，結(jié)果顯示，INF組、NS組大鼠外周血血清、炎性組織PGE2水平高于NOR組；血液和炎性組織PGE2水平均明顯升高，提示疼痛和腫脹主要與該部位PGE2水平升高有關(guān)。INF組與NS組、OT組與ASP組大鼠外周血血清、炎性組織PGE2水平間無差異，表明經(jīng)外周給予催產(chǎn)素后，血液和炎性組織PGE2水平均明顯下降，炎性部位的腫脹程度也明顯緩解，提示外源性催產(chǎn)素可能通過減少炎性部位的PGE2水平、減輕腫脹程度而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

此外，催產(chǎn)素作為一種可由自身產(chǎn)生的神經(jīng)遞質(zhì)，其安全性自然是可靠的。既往研究已充分證明疼痛刺激可引起CNS內(nèi)催產(chǎn)素含量增加，并且可通過多條神經(jīng)通路將催產(chǎn)素輸送到腦的不同區(qū)域以及脊髓參與痛覺信息的調(diào)制，從而發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用［19］，這是哺乳動物個體自主自發(fā)的一種鎮(zhèn)痛機(jī)制。但臨床上要將外源性催產(chǎn)素注射到CNS以達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的，有較大的技術(shù)難度，也存在較高的風(fēng)險。

綜上所述，外源性催產(chǎn)素鎮(zhèn)痛作用明顯，其能降低外周血和炎性組織中PGE2水平，緩解炎性部位的腫脹程度，說明其可能通過抗炎和減少致痛因子進(jìn)而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究初步揭示了催產(chǎn)素在周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的可能機(jī)制，為臨床鎮(zhèn)痛治療提供了新的思路和策略。

作者貢獻(xiàn)：陳紹春進(jìn)行文章的設(shè)計、研究的可行性分析、論文修改，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)；韓毅進(jìn)行文章的構(gòu)思；羅雅范、邸暢、李國萍進(jìn)行研究的實施；羅雅范進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、統(tǒng)計學(xué)分析和論文撰寫。

本文無利益沖突。