5種稻田除草劑對羊角月芽藻的生長抑制研究

沈艷 李沛明 孫如意

摘要 [目的]評價5種稻田除草劑（37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑）對羊角月芽藻生長的抑制作用。[方法]參照《農化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則》，分別測定5種供試藥劑對羊角月芽藻生物量增長的抑制率和生長率的抑制率，計算半效應濃度EyC50和ErC50。[結果]37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑對羊角月芽藻表現為低毒;20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯、30%五·吡·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑對羊角月芽藻均表現中高毒性，對綠藻存在較大風險。[結論]稻田高毒除草劑在實際生產應用中應嚴格控制用量，盡量減小其對綠藻及水生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

關鍵詞 稻田除草劑;羊角月芽藻;生物量增長抑制;生長率抑制

中圖分類號 S482.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）19-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.19.043

Abstract [Objective] To evaluate the growth inhibition of five paddy herbicides on Pseudokirchneriella subcapitata. [Method] The inhibition rate of the yield and average growth rate of five paddy herbicides on? P. subcapitata were determined， and the median effective concentration EyC50 and ErC50 were calculated referring to Test Guidelines on Environmental Safety Assessment for Chemical Pesticides. [Result] The acute toxicity of MCPANa·bentazone on Pseudokirchneriella subcapitata was low toxic;the acute toxicity of penoxsulam·pyrazosulfuronethyl·pretilachlor， pyribenzoxim·cyhalofopbutyl and oxadiargyl were? midhigh toxic， and they were higher risk to green algae. [Conclusion] The dosage of these paddy hightoxic herbicides should be strictly controlled to minimize their harm to the green algae and water ecosystem.

Key words Paddy herbicides;Pseudokirchneriella subcapitata;Biomass growth inhibition;Growth rate inhibition

除草劑是化學農藥中非常重要的一員，據報道，2015年農藥登記產品共計3 295個，其中除草劑934個，占比283%;2015年全國農藥總產量132.8萬t，其中除草劑82.7萬t，占比62.3%[1]。水稻是我國重要的糧食作物之一，稻田中雜草的防治目前仍主要依靠化學防治，稻田除草劑在農業(yè)生產中廣泛應用。暴露于環(huán)境中的除草劑很大一部分可通過土壤浸出、降雨沖刷、地表徑流等途徑進入水生生態(tài)系統(tǒng)，不僅污染水環(huán)境，還對非靶標生物產生潛在毒性[2-3]。

藻類是水生系統(tǒng)的初級生產者，為浮游無脊椎動物、魚類等高等水生生物提供氧氣和食物，在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有至關重要的地位[4]。同時藻類具有個體小、繁殖快、易獲得等特點，且對有毒物質敏感性高[5-7]，因此廣泛應用于化學品、污染物和各種農藥對水生態(tài)系統(tǒng)影響的毒理學研究[8]。而除草劑對藻類的毒性作用最強，其毒性效應遠高于殺蟲劑和殺菌劑[1]。

目前很多研究者進行除草劑對藻類的毒性研究[9-12]，但多數以原藥或單劑為主。筆者選用37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種稻田除草劑（其中2種單劑、3種復配劑），研究其對羊角月芽藻的生長抑制影響，旨在為稻田除草劑安全合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗生物

羊角月芽藻（Pseudokirchneriella subcapitata），購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。選用BG11培養(yǎng)基轉接培養(yǎng)，溫度（23±1）℃，光照時間16 h/8 h，光強4 440～8 880 lx。試驗前進行預培養(yǎng)，每隔96 h轉接一次，連續(xù)轉接3次，使綠藻處于對數生長期。

1.2 試驗藥劑

37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑均由安徽省農業(yè)科學院植物保護與農產品質量安全研究所提供。99.8%重鉻酸鉀由國藥集團化學試劑有限公司提供。

二甲四氯標準品純度99.2%，由安徽豐樂農化有限責任公司提供;滅草松標準品純度98.48%，由江蘇激素研究所提供;嘧啶肟草醚標準品純度99%，由德國Dr.提供;氰氟草酯標準品純度96.5%，由黃山農化有限公司提供;五氟磺草胺標準品純度97%，由青島農冠農藥有限責任公司提供;吡嘧磺隆標準品純度98.3%，由上海農藥研究所提供;丙草胺標準品純度98.1%，由山東濱農科技公司提供;丙炔噁草酮標準品純度96.5%，由黑龍江綠豐源生物科技有限公司提供。

1.3 主要儀器設備

智能人工氣候箱、光學顯微鏡、紫外分光光度計、超凈工作臺、萬分之一電子天平、高壓滅菌鍋、移液器、島津LC-20AT高效液相色譜儀、島津液相色譜質譜聯用儀LCMS-8030、島津GC-2010氣相色譜儀（ECD檢測器）、Agilent GC 7890A氣相色譜儀（ECD檢測器）、Agilent 1200高效液相色譜儀（紫外檢測器）、旋轉蒸發(fā)儀、HC-3018高速離心機、便攜式pH計、光照計、電子溫濕度計等。

1.4 試驗方法

參照《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則》[13]，分別用5種供試藥劑進行預試驗，以較大的間距設置4個濃度組，得出供試藥劑對羊角月芽藻生長受抑制的最低濃度和不受抑制的最高濃度;然后在此濃度范圍內，分別以一定的比例間距（幾何級差控制在3.2倍以內）設置7個濃度組，進行正式試驗。分別取50 mL 配制好的試驗藥液，倒入250 mL 三角瓶中;再加入藻細胞密度在1.0×105個/mL的羊角月芽藻50 mL，使得初始藻種密度控制在5.0×104個/mL左右，搖勻后用封口膜封口，隨機放入智能人工氣候箱。每個濃度組設3個重復。同時以滅菌水加藻液作為空白對照。每天定時人工搖動5～8次。試驗開始后每隔24 h取樣，用血球計數板準確計數藻細胞個數，每個樣品計數3次，同時觀察藻細胞顏色形態(tài)以及是否黏連或聚結等現象。試驗調查持續(xù)72 h。試驗開始后分別在0和72 h留取各濃度組試驗藥液樣品，檢測分析試驗藥液的濃度。

1.5 數據處理與分析

根據試驗期間觀察記錄的數據，分別計算不同濃度組羊角月芽藻生物量增長抑制百分率和生長率增長抑制百分率。處理組藻生物量增長的抑制百分率按公式（1）計算：

Iy=Yc-YtYc×100%（1）

式中，Iy為處理組生物量增長的抑制百分率（%）;Yc為空白對照組測定的藻類單位生物量，用細胞數表示時單位為個/mL;Yt為處理組測定的藻類單位生物量，用細胞數表示時單位為個/mL。

處理組藻類生長率抑制百分率按公式（2）計算：

Ir=μc-μtμc×100%（2）

式中，Ir為處理組藻類生長率的抑制百分率，%;μc為空白對照組生長率的平均值;μt為處理組生長率平均值。其中μ按公式（3）計算：

μj-i=lnXj-lnXitj-ti（3）

式中， μj-i為在時間點i時間點j之間的平均生長率;Xi為在時間點i時的藻類單位生物量，用細胞數表示時單位為個/mL;Xj為在時間點j時藻類單位生物量，用細胞數表示時單位為個/mL。

采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行分析，通過藻生物量增長的抑制百分率和生長率抑制百分率，得到5種供試藥劑對羊角月芽藻半效應濃度72 h-EyC50 和72 h-ErC50、毒力回歸方程以及各自的95%置信區(qū)間。

1.6 供試藥劑對綠藻的毒性判定

試驗結果的毒性等級均參照《化學農藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行劃分，劃分標準見表1。

2 結果與分析

2.1 參比試驗結果

為了解選用的羊角月芽藻的生長狀況及敏感性，試驗之前用重鉻酸鉀進行綠藻參比試驗。重鉻酸鉀對羊角月芽藻的參比試驗結果顯示，其半效應濃度72 h-EyC50為0.077 mg/L，95%置信限為0.062～0.095 mg/L;72 h- ErC50為0.353 mg/L，95%置信限為0.271～0.487 mg/L。以此作為參考。

2.2 綠藻細胞毒性反應

用光學顯微鏡觀察試驗期間羊角月芽藻的毒性反應。綠藻毒性反應癥狀主要表現：藻細胞分解抱團，部分呈絮狀，藻細胞明顯變小，且有斷裂、黏連等現象。高濃度組的藻細胞癥狀出現較早;低濃度組試驗初期癥狀不明顯，隨著藥劑作用時間的延長，毒力效應也逐漸增強，癥狀逐漸明顯。

2.3 供試物水樣濃度

5種除草劑的水樣濃度檢測結果顯示，實測濃度與理論濃度的變化在±20%范圍內，試驗結束時濃度與初始濃度的變化在±10%范圍內，說明5種除草劑產品在試驗體系中較穩(wěn)定，因此采用理論濃度計算半效應濃度及其95%置信區(qū)間。

2.4 5種除草劑對羊角月芽藻生物量增長的抑制效果

于試驗開始后24、48、72 h取樣，在光學顯微鏡下用血球計數板計算藻細胞數。72 h時5種稻田除草劑對羊角月芽藻生物量增長的抑制情況見表2。根據5種稻田除草劑對羊角月芽藻生物量增長的抑制率，采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分別分析半抑制效應結果EyC50，結果見表3。37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種藥劑對羊角月芽藻的半抑制效應結果EyC50分別為10.040、0.123、0.059、0002、0.003 mg/L。根據5種藥劑對綠藻生物量增長的抑制情況，37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑表現為低毒，其他4種除草劑表現為高毒。

2.5 5種除草劑對羊角月芽藻生長率的抑制效果

試驗結束時，對照組綠藻的羊角月芽藻細胞密度達1.35×106個/mL，比試驗初始濃度增加了26倍。各濃度組羊角月芽藻的平均生長率，5種藥劑對羊角月芽藻生長率的抑制百分率（72 h）見表2。用SPSS 20.0分別分析半抑制效應結果ErC50，結果見表4。由表4可知，37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑、20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑、30%五氟磺草胺·吡嘧磺隆·丙草胺可分散油懸浮劑、5%丙炔噁草酮乳油、80%丙炔噁草酮可濕性粉劑5種藥劑對羊角月芽藻的半抑制效應結果EyC50分別為48.445、1.317、0.144、0.008、0.008 mg/L。根據5種藥劑對綠藻生長率的抑制情況，375%二甲四氯鈉·滅草松水劑表現為低毒，20%嘧啶肟草醚·氰氟草酯可分散油懸浮劑為中等毒性，其他3種除草劑表現為高毒。

3 結論與討論

藻類是水生系統(tǒng)的初級生產者，藻類生物量和群落結構的變化會影響水生系統(tǒng)生物鏈的更高營養(yǎng)級，如食草浮游動物和魚類[3，14]。對藻類的危害將影響整個水生生態(tài)鏈，甚至通過食物鏈影響人類的健康[4]。稻田除草劑作為可直接污染水體的重要來源，其安全合理使用日益受到重視[11]。

該研究選擇5種用于直播水稻田或移栽水稻田的除草劑制劑對羊角月芽藻進行生長抑制試驗，結果表明，除375%二甲四氯鈉·滅草松水劑對藻類是低毒外，其他4種藥劑對綠藻均表現為中高毒性，尤其是2個丙炔噁草酮制劑，EyC50為0.002～0.003 mg/L，遠低于0.3 mg/L的高等毒性等級節(jié)點，對綠藻存在較大風險。

目前除草劑對藻類的毒性研究，多數以原藥或單劑為主，而實際農業(yè)生產應用中則多為除草劑制劑。原藥對綠藻的研究僅能反映有效成分本身對綠藻的毒性，無法綜合評估添加助劑等后的制劑產品對水生態(tài)系統(tǒng)的實際影響。目前已有多篇關于殺蟲劑對非靶標動物的毒性研究，與原藥相比制劑對供試生物的毒性更高，如20%丁硫克百威乳油制劑對土壤中蚯蚓死亡率的影響高于原藥[15];50%二嗪磷乳油和10%二嗪磷顆粒劑對鵪鶉和鷓鴣的毒性均比原藥毒性高[16];阿維菌素等8種殺蟲劑原藥對家蠶的LC50 均大于其制劑的LC50[17]。陳兆杰等[11]比較了3種水稻除草劑及其原藥對斑馬魚和羊角月芽藻的急性毒性，結果表明制劑的毒性普遍高于原藥。因此除草劑的毒性研究也應注意原藥和制劑的比較，多關注制劑的毒性。

2018年我國水稻田除草劑登記產品總計484個，其中單劑272個，復配混劑212個[18]，復配劑占比43.8%。多數復配混劑以高效、低毒、不易產生抗性等優(yōu)點，成為農藥登記的熱點。但該研究中3個復配劑只有37.5%二甲四氯鈉·滅草松水劑對藻類表現為低毒，另外2個均為中高毒。因此，除草劑復配劑對水生生物的毒性風險也不容忽視。

該研究是在實驗室條件下進行的，稻田除草劑在田間實際施用時，其對水生系統(tǒng)的影響更為復雜，不僅包括其在自然環(huán)境中降解產生代謝產物的毒性效應[19-20]，還存在殺蟲劑、殺菌劑等多種類型農藥共存的現象，使得除草劑對藻類及水生系統(tǒng)的潛在風險評估難度更大。因此，稻田除草劑在使用時應注意劑型的選擇，盡量選擇低毒除草劑;對于高效高毒除草劑應嚴格控制用藥量，盡量減少其對水生生態(tài)系統(tǒng)的影響。

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