胚乳突變體在水稻淀粉合成調(diào)控研究中的作用

應(yīng)逸寧 龐悅涵 包勁松

(浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/浙江省及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310058)

水稻(Oryza sativaL.)是世界上最重要的農(nóng)作物之一,全球大約有一半的人口以其為主食,同時(shí)水稻也是我國播種面積最大的糧食作物之一[1]。近30年來,中國水稻生產(chǎn)經(jīng)過高產(chǎn)育種、超高產(chǎn)育種、超級稻育種和綠色超級稻育種等計(jì)劃的實(shí)施,水稻產(chǎn)量不斷提高,其中,超級稻的產(chǎn)量在 2015年已達(dá)到了 6 892.5 kg·hm-2的水平[2]。目前,在我國水稻生產(chǎn)中,產(chǎn)量已經(jīng)不是最主要的限制因素。隨著市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高,稻米品質(zhì)改良正逐漸成為水稻育種工作的重點(diǎn)。

淀粉是水稻胚乳中最主要的儲(chǔ)藏物質(zhì),約占水稻胚乳干重的80%,在含水量為14%的精米中,淀粉含量約為76.7%～78.4%[3]。同時(shí),淀粉特性決定了水稻多方面的品質(zhì),尤其是蒸煮和食用品質(zhì)[4]。水稻的蒸煮與食用品質(zhì)通常用直鏈淀粉含量(amylose content,AC)、糊化溫度(gelatinization temperature,GT)、膠稠度(gel consistency,GC)這3個(gè)理化指標(biāo)來衡量[5]。因此,水稻淀粉結(jié)構(gòu)、生物合成等方面的深入研究對水稻品質(zhì)改良具有重要意義。

長期以來,水稻科研工作者盡力發(fā)現(xiàn)和分離有價(jià)值的自然突變和人工突變材料。一方面,突變體具有某些特殊性狀,增加了水稻產(chǎn)量、品質(zhì)性狀的遺傳多樣性,可滿足更大人群食用和工業(yè)生產(chǎn)的需求,同時(shí)也是育種的良好材料。另一方面,隨著水稻全基因組測序工作的完成,水稻突變體已廣泛應(yīng)用于水稻功能基因組學(xué)研究,以鑒定調(diào)控水稻農(nóng)藝、產(chǎn)量、品質(zhì)性狀的突變基因,克隆相關(guān)基因,并研究基因的功能[6]。水稻淀粉生物合成途徑中的相關(guān)基因,都找到了相應(yīng)的突變體,通過尋找基因區(qū)段序列變異及解析基因的功能有力地促進(jìn)了水稻淀粉合成分子生物學(xué)研究的進(jìn)展。

1 水稻淀粉結(jié)構(gòu)

淀粉是一種多聚葡萄糖,由α-(1→4)連接的線性葡聚糖和α-(1→6)連接的分支組成,根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為近線性的直鏈淀粉(amylose)和高度分支的支鏈淀粉(amylopectin)[7]。直鏈淀粉是由葡萄糖α-1,4糖苷鍵連接而成的多聚糖,并帶有一定卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)。支鏈淀粉是由葡萄糖經(jīng)α-1,6糖苷鍵連接而成的多聚糖。在支鏈淀粉的分支簇狀結(jié)構(gòu)中,A鏈沒有分支,聚合度(degree of polymerization,DP)較小,一般為 6～12,其還原端通過α-1,6糖苷鍵連接到B鏈上；B鏈含有若干分支,可細(xì)分為 3種:B1(12＜DP＜25)、B2(25＜DP＜36)、B3(DP＞36)；C鏈位于簇的中心,是支鏈淀粉分子中唯一具有還原端的鏈,DP一般大于60。

在淀粉顆粒中,直鏈淀粉分子不能形成結(jié)晶,而是和支鏈淀粉徑向排列成具有結(jié)晶區(qū)和無定型區(qū)交替層的結(jié)構(gòu)。晶形區(qū)是平面結(jié)構(gòu),而無定形區(qū)是非平面結(jié)構(gòu),因而可以形成超螺旋式三維結(jié)構(gòu)。在這個(gè)三維結(jié)構(gòu)中,雙螺旋葡聚糖鏈密集地平行排列,并且與淀粉顆粒表面垂直[8]。不同物種來源的淀粉顆粒在形態(tài)大小之間存在很大差異。水稻淀粉顆粒由多個(gè)單淀粉粒組成的復(fù)合淀粉粒形式存在于胚乳細(xì)胞中,一般具有多邊形、不規(guī)則的形態(tài)[9]。

2 水稻淀粉生物合成

水稻淀粉合成包括瞬時(shí)淀粉合成和儲(chǔ)藏淀粉合成兩種形式。瞬時(shí)淀粉在白天積累,晚上降解為植物組織提供能量,主要合成場所在葉綠體；而儲(chǔ)藏淀粉能不斷合成和積累,可作為種子發(fā)芽時(shí)的營養(yǎng)物質(zhì),主要合成場所在造粉體[10]。近期,Tetlow等[11]對禾本科植物胚乳中的儲(chǔ)藏淀粉生物合成過程做了詳細(xì)的綜述,包括禾本科不同物種的進(jìn)化關(guān)系、胚乳的發(fā)育、胚乳碳源的供給、淀粉生物合成的過程及淀粉顆粒的形成等。

水稻淀粉合成起始于由光合組織合成的葡萄糖轉(zhuǎn)化而來的蔗糖。蔗糖被運(yùn)送到胚乳中,在蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuS)催化下水解形成果糖和尿苷二磷酸-葡萄糖(uridine diphosphate-glucose,UDPG),UDPG繼而形成葡萄糖1-磷酸(glucose 1-phosphate,G1P),或由蔗糖水解為己糖進(jìn)入胚乳細(xì)胞質(zhì),經(jīng)變構(gòu)酶、己糖激酶等作用轉(zhuǎn)化成G1P。隨后G1P在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)的催化下形成ADP-葡萄糖(ADP-glucose,ADPG)。ADPG再由Brittle1基因編碼的內(nèi)包膜蛋白作用下進(jìn)入造粉體中。此外,G1P可通過假定的G1P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白直接進(jìn)入造粉體,然后在AGPase催化下合成ADPG。ADPG經(jīng)顆粒淀粉合成酶(granulated starch synthase,GBSS)催化合成直鏈淀粉；可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSs)負(fù)責(zé)延長α-(1→4)連接的葡聚糖鏈,而后由淀粉分支酶(branching enzyme,BEs)引入α-(1→6)連接的分支點(diǎn),再由淀粉去分支酶(branching enzyme,DBEs)脫去不合適的分支(圖1),最后合成支鏈淀粉。淀粉合成過程中,這么多酶不可能單獨(dú)作用,而更可能通過協(xié)同作用,共同完成支鏈淀粉合成[10]。除了以上幾種酶外,淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase,SP)和歧化酶(dismutase,DPE)也參與淀粉合成。SP催化一個(gè)可逆反應(yīng),從合成方向,將GlP上的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到α-1,4葡聚糖鏈的非還原端并產(chǎn)生Pi。DPE與質(zhì)體型SP(Pho1)形成蛋白復(fù)合體,參與淀粉合成[12]。此外,SP與其他淀粉生物合成酶也存在相互作用,例如,SSIIa與SSIIIa存在的相互作用就是通過SP進(jìn)行的[13]。上述參與淀粉合成的酶可進(jìn)一步細(xì)分為不同的組織特異性亞型,在某些情況下,還有不同的亞細(xì)胞區(qū)域化[14]。K?tting等[15]對已知淀粉合成通路的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了綜述,包括可逆淀粉磷酸化,氧化還原調(diào)節(jié)和由蛋白磷酸化啟動(dòng)的蛋白質(zhì)復(fù)合體。但是,目前對具體調(diào)控機(jī)制的細(xì)節(jié)所知甚少,更多細(xì)節(jié)還有待研究,如C2位置葡萄糖殘基的磷酸化機(jī)制等[11]。

3 胚乳突變體在水稻淀粉合成分子生物學(xué)研究中的作用

近年來,利用水稻淀粉突變體開展淀粉合成相關(guān)研究取得了一些進(jìn)展。水稻淀粉突變體主要有糯性突變體(waxy,wx)、高直鏈淀粉突變體(amylose-extender,ae)、堊白突變體(chalk,chalky,或chalkiness)、粉質(zhì)突變體(floury,flo)、暗色突變體(dull,du)、糖質(zhì)突變體(sugary,su)和皺縮突變體(shruken,sh)等。與相應(yīng)野生型相比,以上突變體淀粉特性發(fā)生了一系列變化(表1),主要體現(xiàn)在 AC、淀粉粘滯性譜(rapid visco ananlyzer profile,RVA譜)、熱學(xué)特性(用差示掃描量熱儀測定)、支鏈鏈長分布上。通過突變基因的克隆及功能研究,逐步明確了它們在淀粉合成及調(diào)控中作用(圖1、表1),說明胚乳突變體在淀粉合成分子生物學(xué)機(jī)理研究中起著不可替代的重要作用。

3.1 糯性突變體

糯性突變體(糯米)是最早被研究的突變體,其淀粉主要含有支鏈淀粉,僅有極少的直鏈淀粉。由于直鏈淀粉的形成受到影響,糯米的淀粉特性發(fā)生很大變化,使其滿足更多的應(yīng)用需求。1988年Okagaki等[54]克隆了Wx基因。Wx基因位于第6染色體,編碼顆粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSI),是控制直鏈淀粉合成的主效基因,直接影響水稻胚乳和花粉中直鏈淀粉的含量,非糯性基因(Wx)對糯性基因(wx)表現(xiàn)為不完全顯性,存在較為明顯的劑量效應(yīng)。在非糯品種中,Wx基因分化為Wxa和Wxb兩種等位基因,其中,野生稻全為Wxa,秈稻以Wxa為主,直鏈淀粉含量較高；粳稻基本為Wxb,直鏈淀粉含量較低,這表明Wxb基因可能是由Wxa基因馴化而來的[55-56]。與Wxa相比,Wxb的變異是由第一內(nèi)含子剪接位點(diǎn)處G-T變異造成的,突變降低了pre-mRNA的剪接效率,減少了GBSSI的翻譯,進(jìn)而使直鏈淀粉含量降低[57-58]。近年來,在一些地方品種中又鑒定了多個(gè)調(diào)控直鏈淀粉合成的復(fù)等位基因,如Wxin、Wxop、Wxhp、Wxmq和Wxmp等,朱霽暉等[59]對這些復(fù)等位基因進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。

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-42獻(xiàn)R e f e r e n c e s]]]-46]]-47]]文考38 39 43 20布c h a i n l e n g t h d i s t r i b u t io n參[[4 0[[4 4[[4 6[≥和的P＜P鏈加D；P D分D-9增鏈ylopectin短7加少；；長增和P和比-例少少加-13 D；-鏈長粉少-16減 減 減增27-24 13鏈淀10支m≥增 ≥6加 加P AD1 7 D減14P等鏈1 3增-12中支P 12 D＜P D27 PP DD性T h e r m a l p r o p e r ti e s 特學(xué)----低-Tp、熱To 降Tc、△H均降低To、,慢野滯viscosity緩有譜性加只%增別7 4 V asting粘度V%分和-----A粘P RP時(shí)溫和的C91低降升P生V型V P量異)含差粉鏈ylosecontent低顯低低低低高續(xù)1(淀降明降降降降升表直m有A沒體C h r o m o s o m e)1色9 2 1 0 2 8染,4(O s B E I I a)sISAO(8化成磷:淀當(dāng)L U當(dāng)轉(zhuǎn)能G e n e a n d i t s f u n c t io n催形焦1 3恰P p r e- m R N A恰:和p r e- m R N A和:不E 8P功L OT糖應(yīng)L O/F育xb xb不節(jié)IIa W W與9發(fā)除調(diào)除sB因/F OsUgp 1和-葡逆U萄反A胎 切 切 去:與去O:,劑M u t a g e n s基剪 剪PP可U F胚成::1支 參1支鏈1 D的 節(jié)合分 能達(dá) 分支GU酸OsND調(diào)粉Du1 Du3 OsISA的 可表OsISA的移變U N S M U N U N U N U N U N誘M E M M M M M圖P h e n o t y p e 型images/BZ_59_609_835_727_1018.png表images/BZ_59_513_422_689_515.pngimages/BZ_59_518_526_685_789.pngimages/BZ_59_476_807_598_1018.pngimages/BZ_59_484_1037_719_1219.pngimages/BZ_59_503_1234_699_1419.pngimages/BZ_59_504_1434_699_1627.pngimages/BZ_59_504_1638_699_1766.pngimages/BZ_59_515_1884_688_2055.pngimages/BZ_59_515_2066_688_2179.png體M u t a n t s)12初變M E最突flo8 flo13(du1 du3 sug1 sug2稱為s u g 2)(sug-h

乙Tc:獻(xiàn)R e f e r e n c e s酸]]磺]文]]甲考48 data.-52-50 51 53 S perature.:o布c h a i n l e n g t h d i s t r i b u t io n參[4 9[51[[[；temN M E脲e(cuò)ak-’:基P‘硝；；-亞Tp:e.nam分鏈ylopectin少少長變加-N sam-不鏈-36減增-減加 基-10-21增-甲N tem iththe:支m A P P116 1 3≤11 DD perature.e PP DD N nset w U M O焓To:m Tc、△H均降低utant Tc、△H均降低特性T h e r m a l p r o p e r ti e s化；學(xué)Tp、Tp、--Tp、糊:another熱Tc、△H均降低To、To、To、 △viscosity.H；eans度溫*滯viscosity止Setback m譜終:性變SB-----相V asting粘triphosphate.A；viscosity.Tc:RP度溫變C值:UPT低降峰U相:含ridine量大S C)低粉低content低onsistence低大Tp:續(xù)量 ；1(淀鏈ylose降降降降含 度nethane溫化viscosity.表sulfonate.直m A粉淀總體C h r o m o s o m e；To:糊thylE色11 1 8 3值reakdowm染減B:消:MDE S:B；SB發(fā)粉起 對體變重 與合 結(jié),合 值viscosity.E urea.乳淀成能G e n e a n d i t s f u n c t io n和到聚:結(jié) 體 復(fù)胚鏈形合糖 回；C信p aste性起:四功聚/shr2基體:P源D與白麥在:支的?；钚?亞S息復(fù)芽-nitroso與PL2用/shr1四因b大Sugary-2對構(gòu)作 異化特:蛋聚 值知?jiǎng)㎝ u t a g e n s基 期結(jié)PS2要ool異ase催控用G的調(diào)作源重早支形進(jìn)OsAGP ase G成OsAGP OsPho1成低 解:未C:崩育分到A酶構(gòu)要A形D合促成ethyl-N B；“C:-m-”VN viscosity.N；體P:線度變U M變NU U射N U N U N粘突誘M o-γ C M M M終種60:最一V P另p aste；C的o tenthalpy.圖P h e n o t y p eimages/BZ_60_504_673_699_887.pngimages/BZ_60_603_1024_737_1115.pngimages/BZ_60_568_1249_768_1350.pngimages/BZ_60_590_1485_729_1581.png低稱P粘相:度同H:最名H型表images/BZ_60_458_423_746_656.pngVimages/BZ_60_474_1371_579_1581.pngV:P表images/BZ_60_466_908_592_1115.pngH；H*示△；viscosity.Gimages/BZ_60_435_1138_557_1350.png粘磷度酸elatinization eak a/w 2 4值三::峰苷V體M u t a n t s P變*sug-11 sug2/shr1 shr2 Pho1 perature.V P:尿P tem突shr 1:P注TN ote:；U酯onclusionC

3.2 高直鏈淀粉突變體

ae突變體的米粒變小,表面有堊白且皺縮,直鏈淀粉含量顯著提高,碘藍(lán)值升高。高淀粉是發(fā)酵專用品種和淀粉糖工業(yè)專用品種的共同特點(diǎn),有助于提高產(chǎn)物得率。因此,高直鏈淀粉突變稻米不僅是重要的工業(yè)生產(chǎn)和釀酒專用原料,也適宜制作米粉罐頭和貯藏糕點(diǎn)[60]。ae突變基因位于第2染色體,編碼淀粉分支酶IIb(branching enzyme IIb,BEIIb),BEIIb具有轉(zhuǎn)移短鏈的功能。此外,ae突變體不僅BEIIb活性下降,淀粉合成酶Ⅰ(starch synthaseⅠ,SSI)的活性也顯著下降[19]。

3.3 堊白胚乳突變體

堊白是指稻米胚乳中白色不透明的部分,是由于水稻籽粒灌漿不充分,胚乳中的淀粉體和蛋白質(zhì)體充實(shí)不良引起的,以腹白最為常見,心白次之,背白最少。堊白不僅降低了稻米外觀品質(zhì),也降低了碾米品質(zhì)及蒸煮食味品質(zhì)[61],但堊白突變體可用于釀造工業(yè)。

研究表明,稻米堊白性狀屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀,受多基因控制。截至目前共定位到85個(gè)與堊白相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus,QTL),其中有13個(gè)與堊白大小有關(guān),21個(gè)與堊白度相關(guān)的,51個(gè)控制堊白率[62]?？刂扑咀蚜装椎闹餍TLchalk5已被克隆,該基因編碼一個(gè)液泡氫離子轉(zhuǎn)運(yùn)焦磷酸酶,具有無機(jī)焦磷酸水解活性和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性,通過調(diào)控細(xì)胞質(zhì)中氫離子的平衡來間接影響淀粉合成,從而對水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質(zhì)性狀產(chǎn)生影響[63]。Wang等[64]采用γ輻照處理獲得了gif1突變體,其灌漿速度減慢,堊白程度很高,淀粉顆粒發(fā)育不正常且顆粒包裹松散。gif1突變體基因G1F1位于第4染色體,編碼一種細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶,其通過調(diào)控籽粒灌漿初期的碳源分流來影響儲(chǔ)藏物質(zhì)的累積速度。Wang等[65]發(fā)現(xiàn)gpa1突變體比野生型更加白且粉質(zhì)化,掃描電鏡顯示突變體胚乳中復(fù)合淀粉顆粒呈圓形且包裹松散。該突變體積累過多57 kDa谷蛋白前體,難以向蛋白體Ⅱ(PBII)運(yùn)輸,使造粉體的形成受到干擾。gpa1突變基因OsRab5a位于第 12染色體,編碼一個(gè) GTP酶(GTPase),參與胚乳細(xì)胞液泡中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,Wang等[66]還對堊白突變體gpa4進(jìn)行了研究,該突變體囊泡蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷,胚乳包含圓形且松散包裹的復(fù)合淀粉顆粒,千粒重顯著降低,積累過量57 kDa的谷蛋白前體,且成熟谷蛋白40 kDa酸性和20 kDa基本亞基降低,囊泡定位前體增加。該突變基因是位于3號染色體上的GPA4,編碼一個(gè)保守的膜蛋白GOT1B,在水稻胚乳發(fā)育中具有雙重作用,參與醇溶谷蛋白和α-球蛋白的RNA定位到皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng),以及將醇溶谷蛋白和α-球蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出到高爾基體的過程[67]。

Han等[21]發(fā)現(xiàn)T3612突變體灌漿速率降低,胚乳呈粉質(zhì)狀,淀粉顆粒呈圓形且包裹松散,該突變基因是位于第11染色體的PDIL1-1,編碼了一個(gè)類二硫鍵異構(gòu)酶PDIL1-1,該蛋白的缺失對胚乳內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中淀粉體的合成造成了脅迫,從而導(dǎo)致淀粉累積減少并表現(xiàn)出堊白,這說明PDIL1-1對淀粉合成發(fā)揮著重要作用。Matsushima等[68]發(fā)現(xiàn)ssg4突變體堊白增多,種子稍變小,淀粉粒變大,種子淀粉含量降低,但淀粉的結(jié)構(gòu)特性沒有明顯變化；在淀粉積累的其他組織,如花粉粒、根冠及幼嫩果皮,淀粉粒也變大。ssg4突變基因是位于第1染色體的SSG4,編碼一個(gè)定位于造粉體的未知功能新蛋白,會(huì)影響淀粉粒的大小,可能直接參與質(zhì)體的發(fā)育。Li等[23]發(fā)現(xiàn)osbt1突變體呈現(xiàn)心白胚乳,其粒重顯著低于野生型。AC降低,復(fù)合淀粉顆粒的形成和發(fā)育存在明顯缺陷,胚乳中存在許多分散的單粒淀粉,造粉體發(fā)育異常。osbt1突變體中淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了改變。OsBT1編碼一個(gè)假定的ADP葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,該蛋白定位在造粉體被膜中。OsBT1在淀粉合成和復(fù)合淀粉顆粒的形成中起著重要作用。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)osbzip58突變體呈現(xiàn)腹白,堊白部分淀粉顆粒排列松散,AC降低,支鏈淀粉短鏈增多,中長鏈減少。突變基因位于第7染色體,編碼一個(gè)含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的蛋白OsbZIP58。該蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能與6個(gè)淀粉合成相關(guān)基因(SBE1、OsBEIIb、OsSSIIa、Wx、OsAGPL3 和OsISA2)的啟動(dòng)子特異性結(jié)合,調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá),控制淀粉的生物合成。Fu等[25]通過T-DNA插入法得到rsr1突變體,表現(xiàn)為心白胚乳,種子變大,AC增加,支鏈淀粉結(jié)構(gòu)改變,形成圓形且松散堆積的淀粉顆粒,導(dǎo)致GT降低。該突變體缺失基因RSR1位于第5染色體上,編碼一個(gè)AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子,負(fù)向調(diào)控儲(chǔ)藏淀粉合成類基因 (OsAGPL1、OsISA1、OsISA2、OsPUL、OsSSIIa、OsSSIIIa和OsBEIIb)的表達(dá)。

3.4 粉質(zhì)胚乳突變體

粉質(zhì)突變體是堊白的極端表型[69],其胚乳淀粉粒結(jié)合松散,胚乳內(nèi)部表現(xiàn)為粉末狀,而不是正常的透明狀。目前己報(bào)道的粉質(zhì)突變體有9個(gè)(flo1～8、flo13)。Satoh等[26]于1981年利用化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)誘發(fā)產(chǎn)生了突變體flo1,其粒型基本不變,具有類似waxy突變的白胚乳,但能被I2-KI溶液染色成深藍(lán)色,該突變基因位于第5染色體上[27]。flo2突變體的整個(gè)胚乳表現(xiàn)為粉質(zhì),電鏡觀察顯示胚乳中淀粉粒比野生型小,排列松散[28]。FLO2位于第4染色體上[29],在發(fā)育中的種子和葉片中均表達(dá),并且隨著胚乳的發(fā)育,表達(dá)量增加,其編碼一個(gè)包含三角四肽重復(fù)基序(tetratricopeptide repeat,TPR)的蛋白FLO2。該蛋白通過調(diào)控蛋白-蛋白互作,使胚乳蛋白和淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量下降。在flo2突變體中,淀粉合成相關(guān)酶如 AGPase、GBSS、SS和BEIIb等活性下降,從而影響胚乳儲(chǔ)藏物質(zhì)的積累,對種子大小和淀粉品質(zhì)方面起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[28,30]。flo3除了表現(xiàn)為白色胚乳外,胚乳中16 kDa球蛋白含量降低,突變基因位于第4染色體上[70]。flo4突變體是通過T-DNA插入法得到的,出現(xiàn)心白粉狀胚乳但胚乳外部正常,電鏡觀察到在粉質(zhì)胚乳部分,淀粉粒排列松散。突變原因是T-DNA插入到一個(gè)編碼丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK)的基因OsPPDKB第五個(gè)內(nèi)含子中導(dǎo)致該基因失去功能。突變植株中沒有OsPPDKB轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,在發(fā)育胚乳和葉片中由于沒有OsPPDKB蛋白而導(dǎo)致胚乳最終呈現(xiàn)粉質(zhì)性狀[31]。Chastain等[71]分析了水稻發(fā)育中的種子PPDK含量和翻譯后調(diào)節(jié),提出了C3植物的PPDK在磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向丙酮酸形成反應(yīng)的生物合成過程中發(fā)揮作用,且在水稻種子發(fā)育過程中而非種子發(fā)育成熟后發(fā)揮功能。flo5也是T-DNA插入突變體,種子中間部分為粉質(zhì)性狀,外層無變化,中間粉質(zhì)部分的掃描電鏡觀察顯示,淀粉顆粒更小更圓,并且淀粉顆粒很少是透明的。FLO5位于第8染色體,編碼SSIIIa,該蛋白主要負(fù)責(zé)合成支鏈淀粉中的長鏈,在開花后5～15 d表達(dá)量最大[32-33]。此外,SSIIa/SSIIIa的雙抑制株系并未表現(xiàn)出加性特征,表明在淀粉合成過程中SSIIa和SSIIIa基因間存在相互作用。酵母雙雜交試驗(yàn)證實(shí)這個(gè)相互作用可能是通過淀粉磷酸化發(fā)生的,這些結(jié)果表明SSIIa和SSIIIa在水稻籽粒淀粉合成中發(fā)揮著不同的但又有相互重疊的作用[13]。flo6是在組織培養(yǎng)過程中獲得的突變體,灌漿率降低,胚乳變小且不透明,胚乳中淀粉含量明顯減少,淀粉粒減小且雜亂分布,復(fù)合淀粉粒的結(jié)構(gòu)不正常,同時(shí)還觀察到3種不正常的淀粉體。flo6突變基因位于第3染色體上,編碼含有CBM48結(jié)構(gòu)域的蛋白,FLO6通過C-端的CBM48結(jié)構(gòu)域能夠與淀粉結(jié)合,通過N-端的結(jié)構(gòu)域能夠與ISA1結(jié)合,表明在淀粉合成中,它可能在ISA1和淀粉間起到橋梁的作用,參與淀粉合成及復(fù)合淀粉粒形成[34]。flo7突變體胚乳不透明,籽粒外圍表現(xiàn)為白色粉質(zhì)狀,而里層為半透明狀,胚乳外圍淀粉粒排列松散,顆粒形狀不規(guī)則。FLO7編碼綠色植物特有的一種蛋白,屬于DUF1338超家族,蛋白N-端具有作用到造粉體的信號,FLO7在造粉體發(fā)育和外圍胚乳淀粉合成等過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[35-36,72]。誘變劑MNU誘發(fā)的flo8呈現(xiàn)粉質(zhì)胚乳,粒長和粒寬沒有明顯變化,胚乳內(nèi)淀粉粒排列松散,淀粉粒小而圓。該突變是由于單核苷酸替換且一個(gè)8 bp序列插入到UDP-葡萄糖焦磷酸化酶1(Ugp1)基因中導(dǎo)致的。基因互補(bǔ)驗(yàn)證籽粒外觀恢復(fù)正常,表明FLO8編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶1,從而影響胚乳淀粉合成和淀粉粒結(jié)構(gòu)[38]。近期,Hu等[39]利用化學(xué)誘變劑甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘發(fā)得到了突變體flo13,該突變體胚胎致死,種子不能萌發(fā),胚乳粉質(zhì)不透明。突變體淀粉粒組分發(fā)育異常,導(dǎo)致淀粉生物合成受阻,谷粒厚度和千粒重明顯降低。突變基因是位于第2染色體上的OsNDUFA9,編碼線粒體的復(fù)合物Ⅰ亞基,該蛋白的突變導(dǎo)致線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p,從而影響胚乳正常發(fā)育。

3.5 暗色胚乳突變體

暗色突變體胚乳呈暗白色,AC均降低,介于野生型與糯性突變體之間[73]。目前發(fā)現(xiàn)了至少13個(gè)控制AC降低的基因位點(diǎn),這些基因中,除了Wxmq與Wx等位[74],其他均為Wx的非等位基因。由于AC是影響稻米蒸煮和食用品質(zhì)的主要因素,這些基因的研究對水稻品質(zhì)改良非常重要。Satoh等[26]于1981年通過MNU處理受精卵得到了一系列暗色突變體,Yano等[73]將突變體du1-5的突變基因定位于染色體,du1-5均為與Wx非等位的隱性基因。du1基因位于第7染色體,編碼一個(gè)新蛋白Prp1(pre-mRNA processing),該蛋白類似于SR蛋白(serine/arginine-rich proteins)的剪接因子,通過與Wxbpre-mRNA可能的剪接增強(qiáng)子結(jié)合,并在Wxb的2個(gè)隱蔽剪接位點(diǎn)處形成穩(wěn)定的復(fù)合體,從而引導(dǎo)Wxbpre-mRNA的剪接。du1突變體由于未能形成正常的剪接因子,使Wxbpre-mRNA的正常剪接過程受到一定的影響,導(dǎo)致突變體AC的降低,但對剪接后的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?zé)o影響[40,75]。du2突變體對胚乳Wxb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪切效果與du1相似,但du1使花粉中WxbmRNA較胚乳下降更多,而du2反之,說明du1和du2基因位點(diǎn)編碼組織特異性的剪切調(diào)控因子,從而對pre-mRNA進(jìn)行選擇性剪切[40]。du3突變體AC為7%,明顯低于野生型,但高于du1。du3定位于第2染色體的長臂上,編碼一個(gè)CBP20(cap-binding protein 20 KD subunit)的同源蛋白,該蛋白定位在細(xì)胞核中,是帽子結(jié)合復(fù)合體(cap-binding complex,CBC)的一個(gè)組成部分,參與pre-mRNA剪切和外運(yùn)過程。du3中Wxb基因pre-mRNA的剪切效率較du1低[43]。du4突變體基因定位于第4染色體[73],du4和du5突變體產(chǎn)生的分子機(jī)制和功能變化還處于研究中。Koh等[76]通過MNU誘變得到了3個(gè)突變體,突變基因分別為du6(du6a)、du7(du6b)、Du8(Du7t),前兩者為隱性基因,后者為顯性基因。通過EMS誘變得到的2個(gè)突變體以及MNU誘變得到1個(gè)突變體,突變基因分別定位于第6、第9、第6染色體[27]。來自γ輻照NM391突變系的暗胚乳突變體基因暫定命名為du12(t),定位在第6染色體長臂末端的840 bp區(qū)間內(nèi)[77]。以上7個(gè)突變體的突變基因及其功能仍在研究中。

3.6 糖質(zhì)胚乳突變體

Yano等[44]用MNU處理水稻受精卵細(xì)胞,篩選獲得了兩種皺縮的突變體(wrinkled),一種胚乳半透明且堅(jiān)硬,命名為糖質(zhì)突變體；另一種胚乳不透明且易碎,命名為皺縮突變體(見3.7)。雖然它們的外觀及碾米品質(zhì)不佳,但具有特殊的性質(zhì),可用于開發(fā)新用途。

糖質(zhì)突變體胚乳中積累大量可溶性碳水化合物(植物糖原)而不是淀粉。sug1的突變基因是位于第8染色體上的異淀粉酶1基因(ISA1)[20,78],該基因表達(dá)量影響α-葡聚糖分支以及支鏈淀粉、植物糖原的生物合成[45]。sug2突變體中普魯蘭酶基因(PUL)表達(dá)量大大降低,但基因分析表明,sug2并不位于PUL所在的第4染色體上,說明sug2基因產(chǎn)物可能參與PUL的調(diào)控從而影響淀粉的生物合成[20]。Lee等[46]通過MUN誘變得到了一個(gè)輕微的糖質(zhì)突變體sug-h(最初稱為sug2[47]),其表型為sug1和野生型的中間型,輕微皺縮,具有半透明的琥珀色,積累可溶性糖類且AC也增加[47]。研究發(fā)現(xiàn),sug-h的表型由2個(gè)隱性互補(bǔ)基因控制,一個(gè)是異淀粉酶1基因(OsISA1),另一個(gè)是淀粉分支酶IIa基因(OsBEIIa),OsBEIIa的突變可以恢復(fù)部分由OsISA1突變引起的皺縮[46]。Nakagami等[48]通過MUN誘變產(chǎn)生了另一個(gè)sug2突變體,也在胚乳中積累水溶性α-葡聚糖,但該突變體不僅可溶性葡聚糖結(jié)構(gòu)特征與sug1不同,還保留了DBEs的全部活性,同時(shí)也保留SSs、BEs活性。這表明sug2突變基因在胚乳發(fā)育早期對支鏈淀粉分支結(jié)構(gòu)的形成起到重要作用,但該基因目前尚未被克隆。趙華等[49-50]以中花11為材料,通過γ輻照得到了一個(gè)糖質(zhì)突變體,暫命名為Sug-11,在灌漿初期的可溶性糖和蔗糖含量與野生型差異不明顯,在灌漿中后期逐步趨于明顯,AC和直鏈淀粉碘藍(lán)值顯著下降,淀粉的理化特性也有所變化。淀粉合成代謝幾個(gè)關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)變化揭示了Sug-11籽粒中淀粉積累減少、糖分含量增加主要是由籽粒灌漿中后期的PUL轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和DBE活性大幅下降引起的。此外,其AGPase活性在籽粒灌漿前期的顯著下降與籽粒灌漿不良和千粒重下降等現(xiàn)象也存在一定的聯(lián)系。

3.7 皺縮胚乳突變體

皺縮突變體胚乳中蔗糖含量增加而淀粉含量減少,AGPase活性與野生型相比大大降低[20]。無義突變體shr1種子干癟、胚乳不透明、淀粉減少,錯(cuò)義突變體shr1a種子嚴(yán)重萎縮但胚乳透明,兩者都導(dǎo)致種子重量降低。其突變基因位于第1染色體,編碼AGPase的一個(gè)大亞基,L2。AGPase活性測定發(fā)現(xiàn),shr1的AGPase活性為野生型的40%,shr1a的AGPase活性則為野生型的60%。此外,AGPase受到效應(yīng)子3-磷酸甘油酸 (3-phosphoglycerate,3-PGA)和無機(jī)磷的變構(gòu)調(diào)控,但純化重組酶的動(dòng)力學(xué)分析表明,這些AGPase突變體的催化活性和變構(gòu)調(diào)控都嚴(yán)重受損。這些數(shù)據(jù)表明,L2亞基對AGPase異源四聚體酶的催化活性和變構(gòu)調(diào)控特性起著重要作用[51]。shr2的皺縮程度比shr1更大,其突變基因位于第 8染色體上,編碼AGPase的一個(gè)小亞基,S2b。shr2的AGPase活性更低,只有野生型的5%[51]。Satoh等[53]發(fā)現(xiàn)Pho1突變體呈皺縮、干癟狀,粒重降低,總淀粉含量大大降低,淀粉顆粒結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。突變基因編碼質(zhì)體型淀粉磷酸化酶(Pho1),表明Pho1對淀粉生物合成具有一定的作用。此外,Pho1突變體表型受溫度影響,低溫(20℃)條件下種子呈干癟狀,高溫(30℃)條件下成熟種子大多是飽滿的,說明Pho1是在低溫下促進(jìn)淀粉生物合成的,高溫下存在其他因子能夠補(bǔ)充Pho1的功能。

4 結(jié)論與展望

近年來,水稻全基因組測序工作的完成和現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展為水稻胚乳淀粉突變體的研究提供了廣闊的前景。根據(jù)這些突變體的突變基因類型,可大致分為3類。第一類突變體的突變基因編碼淀粉合成相關(guān)酶,如Wx(GBSSI)、ae(BEIIb)、flo5(SSIIIa)、sug1(ISA1)、shr1(AGPase,L2)、shr2(AGPase,S2b)等。這些關(guān)鍵酶的基因已經(jīng)被克隆,功能已基本明確。此外,通過構(gòu)建不同淀粉合成相關(guān)酶的雙突變體組合研究揭示了多種酶協(xié)同其他蛋白共同行使生物學(xué)功能,如通過對ssIIa/ssIIIa雙突變體的研究發(fā)現(xiàn)了SSIIa與SSIIIa能通過SP起作用,兩者行使不同但重疊的功能。目前已證實(shí)水稻淀粉生物合成酶通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成多種具有活性的多酶復(fù)合體[79],但多酶復(fù)合體形成的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。第二類突變體的突變基因編碼淀粉合成基因的調(diào)控因子,如osbzip58編碼一個(gè)含有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能與6個(gè)淀粉合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子特異性結(jié)合；RSR1編碼一個(gè)AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子,負(fù)向調(diào)控儲(chǔ)藏淀粉合成類基因的表達(dá)；flo2編碼一種具有TPR結(jié)構(gòu)的蛋白,調(diào)節(jié)淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)；du1-3編碼剪接因子,對Wxbpre-mRNA進(jìn)行剪接等(表1、圖1)。這些突變基因有些還未被克隆,有些雖已被克隆,但調(diào)控的分子機(jī)理尚不十分清楚。此外,這些調(diào)控因子之間是否存在互相聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。第三類突變體的突變基因的編碼產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及其他生理過程來間接影響淀粉的生物合成,如G1F1編碼一種細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶,其通過調(diào)控籽粒灌漿初期的碳源分流來影響儲(chǔ)藏物質(zhì)的累積速度；OsRab5a編碼一個(gè)GTP酶,參與胚乳細(xì)胞液泡中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)；OsNDUFA9編碼線粒體的復(fù)合物Ⅰ亞基,該蛋白受損影響胚乳正常發(fā)育。第二和第三類突變體仍有待挖掘和深入研究。水稻胚乳淀粉的合成與調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜又精細(xì)的過程,通過對現(xiàn)有突變體的研究,已經(jīng)有了一定程度的了解,但距離完全闡明還很遠(yuǎn)。

水稻胚乳淀粉突變體研究不僅具有理論意義,也具有培育優(yōu)質(zhì)及特殊功能品種的實(shí)踐意義。突變體的利用可加快改良原有種質(zhì)資源和培育新種質(zhì)資源,現(xiàn)已成為作物改良的有效手段之一[80]。目前獲得水稻淀粉突變體的誘變方法主要有物理誘變(γ射線)、化學(xué)誘變(MNU、EMS)和插入誘變(T-DNA插入)(表1)。將傳統(tǒng)誘變方法與目標(biāo)突變體定向篩選技術(shù)(如TILLING技術(shù)[81])相結(jié)合能快速有效地從誘變?nèi)后w中獲得鑒定結(jié)果,加快突變體的挖掘與創(chuàng)新,豐富現(xiàn)有的育種材料。此外,利用突變體研究逐步闡明的淀粉合成分子基礎(chǔ)與調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò),為運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇以及轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代分子育種技術(shù)開展稻米品質(zhì)改良提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。將常規(guī)育種技術(shù)與現(xiàn)代分子育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合,能夠加快水稻淀粉品質(zhì)性狀的遺傳改良,進(jìn)一步提高現(xiàn)有稻米的品質(zhì),以滿足人們?nèi)找嬖鲩L的多樣化消費(fèi)需求。