利用分子標記輔助選育香軟型保持系“SH101B”、不育系“SH101A”及配組分析

王彤 曾文秀 王冬翼 趙國超 李建粵

摘 要： 為了給三系雜交稻新品種選育提供優(yōu)良親本，以“嘉花1號”水稻為轉育親本，與香型軟米水稻雜交，再與“嘉花1號”水稻多代回交及自交，結合分子標記輔助選育香軟型水稻新品系“SH101B”.“嘉花1號”與“SH101B”水稻主要農藝性狀和產量性狀差異都不顯著（p>0.05）.“SH101B”稻米直鏈淀粉含量（質量分數）為10.0%，明顯低于“嘉花1號”水稻（15.2%）.又將“SH101B”與三系不育系水稻雜交和回交，轉育獲得香軟型三系不育系“SH101A”，再與秈型恢復系“T201”進行配組，并對后代農藝性狀、產量和稻米品質進行分析.結果顯示，“SH101A×T201”組合稻米直鏈淀粉含量為12.8%，每畝產量達到848.1 kg（12726.4 kg·hm-2）.

關鍵詞： 香軟水稻; 分子標記輔助選育; “SH101B”; “SH101A”; 雜交組合

中圖分類號： S 511.037 ?文獻標志碼： A ?文章編號： 1000-5137（2019）05-0550-07

Abstract： In order to provide excellent parents for breeding new cytoplasmic male sterility（CMS） line rice varieties，we developed a new rice strain，“SH101B”，by molecular marker-assisted gene pyramiding，using hybridizing between non-fragrant and non-soft rice “Jiahua No.1” with a fragrant soft rice，and backcrossing with “Jiahua No.1” rice for multi-generation，and then selfcrossing.There were no significant differences between “Jiahua No.1” and “SH101B” in main agronomic and yield traits （p>0.05）.The amylose content （mass fraction） of “SH101B” rice was 10.0%，which was significantly lower than that of “Jiahua No.1” rice （15.2%）.In this study，“SH101B” was crossed and backcrossed with three-line sterile line rice to obtain fragrant and soft three-line sterile line “SH101A”，which was then paired with Indica restorer line “T201”，and its offspring were analyzed for agronomic traits，yield and rice quality.The results showed that the amylose content of “SH101A×T201” rice was 12.8% and the yield reached 12726.4 kg·hm-2.

Key words： fragrant and soft rice; molecular marker assisted breeding; “SH101B”; “SH101A”; hybrid combinations

近年來，隨著人們生活品質的不斷提升，人們對稻米品質的要求也逐漸提高，因此相關研究越來越受到研究人員的重視[1].稻米的品質主要分為蒸煮品質、食味品質、營養(yǎng)品質、外觀品質和加工品質，其中，食味品質是最重要的評價指標[2].稻米的食味品質受其自身直鏈淀粉含量（質量分數）、香味物質、膠稠度等影響[3].NELSON等[4]發(fā)現水稻蠟質基因（Wx）通過編碼顆粒結合淀粉合成酶可控制直鏈淀粉的合成.一般而言，稻米直鏈淀粉含量（質量分數）小于15%，其食味品質較好[5]，因此，降低稻米直鏈淀粉含量是提高稻米品質的主要途徑之一.

香味也是稻米重要的食味品質性狀之一，因此，稻米香味的研究已經成為一項至關重要的研究課題.有文獻報道，在水稻8號染色體上編碼甜菜堿醛脫氫酶2基因（Badh2）與水稻香味有直接聯系[6].當Badh2在水稻中大量表達時，其稻米不具有香味;而當Badh2突變導致表達量下降時，水稻體內的香味物質2-乙酰-1-吡咯啉會大量積累，使稻米產生獨特的香味[7-8].

改良不育系品質可提高雜交稻的米質.三系不育系（CMS）是三系雜交水稻重要親本之一.然而對于三系雜交稻而言，改良不育系首先需要選育出優(yōu)質的保持系水稻.“嘉花1號”是嘉興市農科院采用雜交育種與花粉培養(yǎng)技術相結合選育的晚粳水稻，2002年和2003年在上海市水稻區(qū)域試驗中平均產量8735.25 kg·hm-2（即畝產582.35 kg）[9].盡管“嘉花1號”水稻產量低于近幾年新選育的常規(guī)水稻，但本文作者觀察發(fā)現，“嘉花1號”具有較好的開花習性，適合轉育成三系不育系.

本研究采用分子標記輔助選育技術，將香味基因和軟米基因導入“嘉花1號”水稻，培育出香軟型水稻新品系“SH101B”，進而選育出香軟型三系不育系“SH101A”，再將不育系與秈型恢復系“T201”進行配組.開展本研究可為今后培育三系雜交水稻新品種提供優(yōu)質親本.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究的試驗材料分別為：1）“嘉花1號”水稻（審定編號：滬農品審水稻2003第065號）;2）本課題組在選育香軟型“秀水123”水稻中獲得的同時含有香味基因和軟米基因的中間材料“XR-123”;3）本課題組曾將三系雜交稻“寒優(yōu)湘晴”母本“寒豐A”不育系與“嘉花1號”水稻雜交和回交，已轉育成的“嘉花1號A”三系不育系;4）秈型恢復系水稻“T201”.

1.2 分子標記檢測香味基因和軟米基因

提取水稻葉片總DNA.參考許言福等[10]報道的方法進行水稻香味基因檢測.水稻軟米基因檢測操作參照謝米雪等[11]的報道.

1.3 水稻主要農藝性狀以及產量性狀分析

水稻成熟時，在上海師范大學閔行區(qū)水稻種植基地分別隨機取“嘉花1號”和“SH101B”水稻植株各5棵，測量株高，記錄每株的有效穗數、每株總粒數和每株實粒數，計算結實率，稱量千粒重和單株重.對數據進行標準方差計算，并采用t檢測進行差異顯著性統(tǒng)計分析.

在上海市浦東新區(qū)農業(yè)技術推廣中心基地對“SH101A×T201”組合植株的株高、有效穗數、葉長、每穗總粒數、結實率、產量等數據進行測量.

1.4 稻米品質指標分析

取“嘉花1號”、“SH101B”水稻，以及“SH101A×T201”組合后代稻谷各500 g，送農業(yè)農村部稻米及制品質量監(jiān)督及檢驗測試中心，進行稻米品質指標分析.

2 結果與分析

2.1 “SH101B”水稻選育過程

2011年9月，在海南將“嘉花1號”水稻作為母本，與含有香味基因和軟米基因的“XR-123”水稻雜交獲得F1種子.2012年3月將F1植株作為父本與“嘉花1號”水稻回交，獲得BC1F1種子.2012年9月，又將BC1F1植株作為父本與“嘉花1號”水稻回交，得到BC2F1種子.在2013年3月，BC2F1植株再次與“嘉花1號”水稻回交，收獲BC3F1種子.同樣，在2013年9月，再次將BC3F1植株與“嘉花1號”水稻回交，得到BC4F1種子.

在每次回交前先觀察回交植株，選取農藝性狀接近“嘉花1號”水稻，但開花時期略早于“嘉花1號”水稻的植株取葉片，進行香味基因和軟米基因檢測，選擇同時含有香味基因和軟米基因的植株再與“嘉花1號”水稻進行回交.

2013年12月—2014年4月，在海南種植BC4F1植株，收獲BC4F2種子.在2014年5—10月，在上海大量種植BC4F2植株，9月初篩選株型好、開花習性與“嘉花1號”水稻接近，但開花略早幾天的單株，10月中下旬收獲BC4F3種子.從2014年12月—2015年10月，分別在海南和上海對BC4F3種子進行加代繁殖.加代繁殖期間，對不同單株種植的小區(qū)進行各項農藝性狀、開花時期、開花習性及成熟期的考察，于2015年9月獲得各項性狀穩(wěn)定的后代，10月收獲BC4F5種子（圖1）.收獲自交植株種子前，也需要采用分子標記對植株進行香味基因和軟米基因的檢測和篩選.

2.2 “SH101A”水稻選育過程

2015年3月，從培育“SH101B”的BC4F3小區(qū)中選出同時含有香味基因和軟米基因的單株，與三系不育系“嘉花1號A”水稻雜交，收獲F1種子.接著依次分別在上海和海南從“SH101B”群體中選擇優(yōu)良單株作為轉育親本，與不育植株進行成對回交至5代，于2017年9月收獲BC5F1種子，獲得“SH101A”不育系（圖2）.

在“SH101A”不育系選育期間，結合田間觀察花藥、顯微鏡檢測經碘-碘化鉀染色的花粉粒，以及穗子套袋觀察自交結實，保留花藥不開裂，花粉粒不能染色，套袋無結實的植株.

2.3 香味基因分子標記檢測

按照許言福等[10]的報道，水稻基因組DNA的擴增產物為667 bp，含有正常Badh2基因水稻的聚合酶鏈式反應（PCR）產物經EheⅠ內切酶酶切后，可被酶切成292 bp和375 bp 2種長度的DNA條帶，而含有突變型Badh2基因水稻的PCR產物的DNA沒有酶切位點，其條帶大小仍為667 bp，雜合植株的條帶大小為292，375，667 bp 3種長度的DNA條帶.

以“青香軟粳”和“嘉花1號”2種水稻分別作為香型和非香型水稻的對照，分析在培育“SH101B”和“SH101A”水稻期間的回交或自交植株.在檢測過程中，對于“SH101B”回交植株條帶會出現2種類型：1）同時具有292，375，667 bp 3種條帶，表示Badh2基因為雜合;2）出現292 bp和375 bp 2種條帶，表示植株含有正常的Badh2基因.選取同時具有3條帶的植株作為父本進行回交（圖3）.對于“SH101B”自交植株Badh2基因檢測條帶會出現3種類型：1） 具有292，375，667 bp 3種條帶;2） 只有667 bp 1種條帶;3）有292 bp和357 bp 2種條帶.這3種類型的條帶分別表示Badh2基因對應的植株為雜合、純合香型和非香型3種基因型.對于BC4F2和BC4F3植株篩選，可以保留Badh2基因呈雜合的植株，但對于BC4F4植株檢測，只保留含有667 bp 1種條帶的純合香型植株（圖4）.

對于“SH101A”水稻轉育過程中，由于父本“SH101B”含有純合香味基因，因此，在進行第二次回交前，可先采用分子標記檢測不育系，取香味基因已純合的植株再繼續(xù)與“SH101B”水稻進行回交.

2.4 軟米基因分子標記檢測

采用謝米雪等[11]報道的軟米基因檢測方法，水稻基因組DNA擴增產物為557 bp.軟米水稻基因組DNA的PCR擴增產物經NlaⅢ內切酶酶切后，可被剪切為380 bp和177 bp 2種長度的DNA條帶，而不含軟米基因的水稻DNA由于沒有酶切位點，其PCR產物不能被NlaⅢ內切酶消化，條帶大小仍為557 bp.

以“青香軟粳”和“嘉花1號”2種水稻分別作為軟型和非軟型水稻的對照，分析了在培育“SH101B”和“SH101A”水稻期間的回交或自交植株.在檢測過程中，對于“SH101B”回交植株條帶會出現2種類型：1）同時具有557，380，177 bp 3種條帶;2）只有557 bp 1種條帶.選取同時具有3種條帶的植株作為父本進行回交（圖5）.對于“SH101B”自交植株軟米基因檢測條帶會出現3種類型：1）同時具有557，380，177 bp 3種條帶;2）只有557 bp 1種條帶;3）有380 bp和177 bp 2種條帶.這3種條帶分別表示軟米基因對應的植株為雜合、非軟和純合軟米.同樣，對于BC4F2和BC4F3植株檢測，可以保留軟米基因雜合的植株，而對于BC4F4植株，只保留含有380 bp和170 bp 2種條帶的純合軟米植株（圖6）.

在“SH101A”水稻轉育過程中，由于父本“SH101B”含有純合軟米基因，在進行第二次回交前，也可以先通過分子標記檢測不育系，取軟米基因已純合的植株再繼續(xù)與“SH101B”水稻進行回交.

2.5 “嘉花1號”和“SH101B”水稻主要農藝性狀、產量性狀及品質分析

2018年5月20日，在上海種植“嘉花1號”和“SH101B”2種水稻，大約在8月底至9月初揚花，10月中下旬成熟，總生育期為152155 d.“SH101B”水稻總生育期比“嘉花1號”水稻短23 d.“嘉花1號”和“SH101B”水稻的穗長、株高、單株有效穗數較為接近（表1）.比較兩者的主要產量性狀發(fā)現，盡管2種水稻的每穗總粒數、每穗實粒數、結實率、千粒數、單株重等指標的統(tǒng)計分析結果都沒有達到顯著性差異（p>0.05），但“SH101B”水稻這些相應指標的平均值都高于“嘉花1號”水稻（表2）.

“嘉花1號”和“SH101B”水稻稻米外觀品質和食味品質檢測結果如表3所示.與“嘉花1號”水稻比較，“SH101B”水稻稻米直鏈淀粉含量明顯下降，由15.2%降為10.0%.另兩項食味品質指標：堿消值和膠稠度，2種水稻之間接近或相同.“SH101B”水稻3項外觀品質相比“嘉花1號”水稻都略有下降.

2.6 “SH101A”與“T201”水稻雜交組合植株主要農藝性狀、產量性狀及品質分析

在上海2018年5月25日種植“SH101A×T201”雜交水稻，植株于9月5日始穗，10月30日成熟，總生育期153 d.“SH101A×T201”植株穗大，莖稈粗壯，株高118 cm，穗長19 cm，上3張功能葉葉長分別為46，46，28 cm，平均每穗總粒數250.3粒，實粒數234.8粒，結實率93.8%，千粒重（質量）25.3 g，每畝有效穗數1.45×105，實際小區(qū)產量12726.4 kg·hm-2（即每畝848.1 kg）.

“SH101A×T201”水稻稻谷經檢測，糙米率為82.5%，精米率74.6%，整精米率63.8%，粒長5.4 mm，長寬比2.1，堊白粒率15%，堊白度3.3%，透明度2級，堿消值5.8，膠稠度78 mm，直鏈淀粉含量12.8%.

3 討 論

目前已有一些關于選育香型[12-16]或較低直鏈淀粉含量三系不育系的報道[17-19].但是對于已培育的稻米具有香味同時直鏈淀粉含量約為10%的三系不育系目前還鮮有報道.本研究采用分子標記輔助篩選成功培育了同時含有香味基因和Wxmq軟米基因的常規(guī)水稻，并成功轉育了相應的不育系，獲得了既有香味同時稻米直鏈淀粉含量又較低的粳型不育系水稻新品系，可為今后上海市培育優(yōu)質三系雜交稻提供優(yōu)質的不育系水稻親本.

本研究使用的恢復系“T201”也是超高產三系雜交稻“浦優(yōu)201”的父本[20].“浦優(yōu)201”稻米直鏈淀粉含量為16.1%[20].將本研究培育的“SH101A”與“T201”雜交獲得“SH101A×T201”組合，稻米直鏈淀粉含量僅為12.8%，明顯低于“浦優(yōu)201”.一般雜交稻米的直鏈淀粉含量介于兩個親本之間[21].正是由于“SH101A”不育系稻米直鏈淀粉含量較低，才使得“SH101A×T201”雜交組合后代稻米直鏈淀粉含量也相應被降低了.

“浦優(yōu)201”雜交稻2012年和2013年參加上海市水稻區(qū)域試驗，每畝平均單產786.1 kg.2015年參加上海市水稻生產試驗，“浦優(yōu)201” 每畝平均單產800.7 kg.“浦優(yōu)201” 3年平均每畝產量為793.4 kg.“SH101A”與“T201”雜交的“SH101A×T201”組合，畝產為848.1 kg，也高于“浦優(yōu)201”水稻.

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（責任編輯：顧浩然）