河道水體黑臭前后微生物種群變化研究

王鵬 劉梅 翁益松 鄭海宏 孫靜亞

摘要?[目的]探究河道水體黑臭前后微生物群落的變化，為河道水體黑臭機(jī)制研究提供依據(jù)。 [方法]對河道水體黑臭前、黑臭中、黑臭后的水質(zhì)進(jìn)行高通量測序，進(jìn)行微生物多樣性分析。[結(jié)果]微生物多樣性分析結(jié)果表明，確定水中引起黑臭變化的硫酸鹽還原菌優(yōu)勢屬種為狹義梭菌屬嚴(yán)格芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、甲苯單胞菌屬、伯克氏菌屬、馬賽菌屬等優(yōu)勢種群，并得出關(guān)鍵致黑致臭微生物種群Clostridium sensu stricto 1，這一菌種在黑臭水體中的數(shù)量約20 000 cell/mL以上，占比64.09%，為黑臭核心微生物種，致黑臭微生物種群Clostridium sensu stricto 1為狹義梭菌屬嚴(yán)格芽孢桿菌屬類，具有硫酸鹽還原功能，是主要的硫酸鹽還原菌種群。[結(jié)論]硫酸鹽還原菌Clostridium sensu stricto 1在河道黑臭過程中起到關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞?河道水體;黑臭;微生物多樣性;硫酸鹽還原菌

中圖分類號?X172文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0047-05

Abstract?[Objective]The research aimed to explore the changes of microbial community before and after the black and odorous in river water， and to provide the basis for the study on the mechanism of black and odorous in river water. [Method] High flux sequencing and microbial diversity analysis were carried out on the water quality of the river water before， in and after the black and odorous. [Result]The results of microbial diversity analysis indicated that the dominant species of sulfatereducing bacteria that determined the change of black odorous in water were Clostridium narrowly strict bacillus， Clostridium perfringens，Toluenomonas， Burkholderia and Massilia.And the key black odorcausing microbial population Clostridium sensu stricto 1 was derived，the amount of this strain in black odorous water was about 20，000 cells/mL or more， accounting for 64.09%， which was a black odor core microbial species， and the black odorous microbial population Clostridium sensu stricto 1 was Clostridium narrowly strict bacillus. It had a sulfate reducing function and was the main sulfate reducing bacteria population.[Conclusion] Sulfatereducing bacteria Clostridium sensu stricto 1 plays a key role in the black and odorous process of river.

Key words?River water body; Black odorous;Microbial diversity;Sulfatereducing bacteria （SRB）

硫酸鹽還原菌是一種典型的厭氧微生物，通常簡稱SRB，一般存在于地下、土壤、黑臭河道水體等缺氧環(huán)境中，硫酸鹽還原菌的主要作用就是能夠還原硫酸鹽和亞硫酸鹽，產(chǎn)生H2S[1-2]。

硫酸鹽還原菌所具有的硫酸鹽還原功能是導(dǎo)致其細(xì)菌所在的水體環(huán)境或其他厭氧環(huán)境產(chǎn)生黑臭的主要原因之一，它利用各種有機(jī)物為電子供體，使硫酸鹽作為電子受體，在厭氧硫酸鹽還原過程中，持續(xù)消耗有機(jī)物，使之持續(xù)性為硫酸鹽、硫酸根離子或其他含硫物質(zhì)離子提供電子，還原硫酸根離子、亞硫酸根離子產(chǎn)生硫化氫、硫脒等一類含硫物質(zhì)[3-4]，使硫酸鹽還原菌所存在環(huán)境惡臭，并在同步還原過程中使環(huán)境中存在的致黑因子如鐵錳等離子還原為低價(jià)離子，如硫化亞鐵與硫化錳等，使所存在的環(huán)境變黑。該研究通過分析河道水體在黑臭過程中微生物種群的變化，揭示硫酸鹽還原菌在水體黑臭中的作用。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料?黑臭河水底泥選自于某城市已發(fā)生黑臭的河道底泥，祛除可見不同類雜質(zhì)后冷藏保存。培養(yǎng)基選用硫酸鹽選擇性培養(yǎng)基（Postgate培養(yǎng)基）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?微生物取樣。為探究黑臭過程水中微生物多樣性的變化，將河水按照5%體積比接種污泥，取3組樣品進(jìn)行分析。第1組為黑臭前，第2組為黑臭中，是培養(yǎng)3 d后取樣，第3組為黑臭后，是培養(yǎng)7 d后取樣。

1.2.2?測序流程。Illumina測序的內(nèi)容包括基因組DNA[5]提取，設(shè)計(jì)并合成引物接頭，PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，PCR產(chǎn)物定量和均一化，Illumina PE 300文庫制備，Illumina 高通量測序[6]。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA[7]。

1.2.3?基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增。將3組樣品利用OmegaBioket公司的D5625-Soil-DNA試劑盒完成基因組DNA提取[8]，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA，隨后送至上海元莘生物公司進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建，采用PE250測序平臺完成Illumina測序，測序區(qū)域?yàn)?15F-907R，PCR擴(kuò)增所用正向引物為515F：5′- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，反向引物為907R：5′- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′;全部樣本按照正式試驗(yàn)條件進(jìn)行，每個樣本3個重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測[9]。

PCR 采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O 至 20 μL。

PCR 反應(yīng)參數(shù)：a.1×（5 minutes at 95 ℃），b.27×（30 seconds at 95 ℃;30 seconds at 55 ℃;45 seconds at 72 ℃），c.10 minutes at 72 ℃，10 ℃ until halted by user。

1.2.4?熒光定量。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）[10]進(jìn)行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.5?生物信息分析。OTU聚類是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個分類單元（品系，屬，種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志[11]。OTU聚類（operational taxonomic units）使用：Usearch vsesion 7.1（http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺對測序結(jié)果進(jìn)行修剪、篩選、匹配和分析。要了解一個樣本測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進(jìn)行歸類操作（cluster）。通過歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU?？筛鶕?jù)不同的相似度水平，對所有序列進(jìn)行OTU劃分，通常對在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析[11]。

分析步驟如下：

對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，便于降低分析中間過程冗余計(jì)算量，去除沒有重復(fù)的單序列，按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格[11]。

2?結(jié)果與分析

2.1?PCR擴(kuò)增結(jié)果鑒定膠圖

從圖1可以看出，樣品（Lane 1-3）在500 bp大小處有一條明亮的帶，與目的基因的大小一致，表明目的基因可能成功擴(kuò)增得到。后續(xù)的測序結(jié)果表明，該500 bp大小處片段的序列與目的基因的序列一致，表明目的基因成功擴(kuò)增（重組質(zhì)粒成功構(gòu)建）。

2.2?多樣性分析結(jié)果

多樣性分析結(jié)果中（表1），各指數(shù)表現(xiàn)相似性水平為0.97，樣品有效，黑臭前OTU數(shù)值（486）與黑臭中OTU數(shù)值（678）差別較大，黑臭中樣品豐度大于黑臭前樣品，原因推測在黑臭產(chǎn)生過程中有同源相似性微生物大量繁殖。

2.3?PCoA分析

PCoA分析，即主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis），也是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性[10]。黑臭中的樣品群落結(jié)構(gòu)組成基于79.85%的變異系數(shù)與其他2個樣品顯著不同，黑臭前與黑臭后樣品基于PC2（20.15%）分離，3個樣品微生物菌落組成存在差異性。

2.4?群落結(jié)構(gòu)組成

水體黑臭3個階段的樣品經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)后確認(rèn)PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適[5]，可進(jìn)行后續(xù)微生物多樣性測序試驗(yàn);以門、綱、目、科、屬5個水平的群落組成[10-11]如表2所示。

如圖3所示，黑臭前優(yōu)勢門Proteobacteria占比95.7%，在樣品中為主要微生物群落，但在黑臭暴發(fā)期間，微生物Proteobacteria大量減少，微生物Firmicutes成為優(yōu)勢門，占比74.3%，在黑臭之后，Proteobacteria逐漸升高成為優(yōu)勢門，可知在整個黑臭時間段內(nèi)，F(xiàn)irmicutes門先升高后逐漸減少，那么Firmicutes是影響黑臭的關(guān)鍵門，屬類水平中可以發(fā)現(xiàn)，在黑臭前Pseudomonas的占比為77.81%，但在黑臭暴發(fā)期間，Clostridium sensustricto 1屬成為優(yōu)勢屬，占比64.09%，在黑臭后，Clostridium sensu stricto 1屬減少，可知在黑臭期間關(guān)鍵微生物屬為Clostridium sensu stricto 1（嚴(yán)格厭氧芽孢桿菌屬1）。

2.5?核心基因組Heatmap分析

Heatmap是用顏色變化來反映二維矩陣或表格中的數(shù)據(jù)信息[12]，它可以直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。常根據(jù)需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行物種或樣本間豐度相似性聚類，將聚類后數(shù)據(jù)表示在Heatmap圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性[11]。圖4所示，對比黑臭期間3個不同階段，黑臭中階段的微生物Clostridium sensu stricto 1、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Tolumonas、Massilia等大量繁殖，在熱圖中顯示明顯，在黑臭前顯示不明顯，為劣勢微生物屬，但在水體發(fā)生黑臭時，這幾類微生物屬大量繁殖，在熱圖所示黑臭中其百分比明顯，為優(yōu)勢微生物屬，但在黑臭后除Tolumonas（甲苯單胞菌屬）外，其他優(yōu)勢菌屬逐漸凋亡。

2.6?核心微生物菌種

如表3所示，黑臭暴發(fā)期間關(guān)鍵優(yōu)勢微生物屬種Clostridium sensu stricto 1在黑臭中的數(shù)量約20 000以上，占比64.09%，F(xiàn)uchs等[13]在探究產(chǎn)氣莢膜梭菌對產(chǎn)生硫化氫的研究中提到Clostridium sensu stricto屬的產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠還原硫酸根離子產(chǎn)生H2S氣體。Takahashi等[14]在硫酸鹽還原富集培養(yǎng)物分離得到的梭狀芽孢桿菌證明了狹義梭菌屬為硫酸鹽還原菌，Laishley等[15]在研究亞硫酸鹽還原中提到狹義梭菌屬能還原亞硫酸鹽產(chǎn)生含硫氣體等。Achá等[16]在探究大型植物外菌株汞甲基化和硫化氫中提到了甲苯單胞菌屬（Tolumonas）能夠還原硫酸根離子產(chǎn)生H2S;Giri等[17]與Kumar等[18]在研究揮發(fā)性有機(jī)硫化物與伯克氏菌相互關(guān)系時證明Burkholderia菌屬有硫酸鹽還原并產(chǎn)生含硫氣體的功能。

2.7?系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹[19]在生物學(xué)中用來表示物種之間的進(jìn)化關(guān)系。在進(jìn)化樹上每個葉子結(jié)點(diǎn)代表一個物種，如果每一條邊都被賦予一個適當(dāng)?shù)臋?quán)值，那么2個葉子結(jié)點(diǎn)之間的最短距離就可以表示相應(yīng)的2個物種之間的差異程度[20]。如圖5所示優(yōu)勢種群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中12個菌種來源于核心優(yōu)勢屬類，抽取各種群菌種關(guān)鍵基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，菌株Tolumonas osonensis strain OCF 7與菌株Aeromonadaceae bacterium 130I2自比值在95以上，可以證明這2株菌可能是一個祖先進(jìn)化而來，存在相同的基因功能，同理Bacterium H4與Tolumonas auensis strain DSM 9187親緣度較高，存在相同的基因功能。Burkholderia與Massilia菌類親緣度同樣較高，存在相同的基因功能。Clostridiales bacterium AU537，Clostridium beijerinckii NRRL B-598同樣存在相同基因功能。

3?結(jié)論與討論

河道黑臭過程中微生物多樣性分析表明，產(chǎn)生黑臭的硫酸鹽還原菌具體的屬種為狹義梭菌屬嚴(yán)格芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、甲苯單胞菌屬、伯克氏菌屬、馬賽菌屬等優(yōu)勢種群，并得出關(guān)鍵致黑致臭微生物種群Clostridium sensu stricto 1，這一菌種在黑臭水體中的數(shù)量約20 000 cell/mL以上，占比64.09%，為黑臭核心微生物種。

致黑臭微生物種群Clostridium sensu stricto 1為狹義梭菌屬嚴(yán)格芽孢桿菌屬類，具有硫酸鹽還原功能，利用水體中的硫化物充當(dāng)電子受體，通過還原硫化物產(chǎn)生硫化氫等致臭物質(zhì)，還原過程中產(chǎn)生的S2-與自然水體中存在的Fe2+、Mn2+生成FeS、MnS，這一類含硫物質(zhì)是關(guān)鍵的水體黑化污染物。對致河道水體發(fā)生黑臭變化的關(guān)鍵微生物種群進(jìn)行研究為探究河道黑臭原因分析與河道黑臭治理提供理論基礎(chǔ)。

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