免疫親和柱在果蔬有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測定前處理中的應(yīng)用研究

楊 柳，朱杰麗，柴振林，尚素微，吳翠蓉，蔣步云，方 燕

（浙江省林產(chǎn)品質(zhì)量檢測站，浙江 杭州 310023）

目前有關(guān)水果、蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測的前處理方法報道較多，并主要體現(xiàn)在提取液配置及提取后的凈化處理上[1-2]。其中應(yīng)用最為廣泛的是NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》[3]，方法規(guī)定有機(jī)磷農(nóng)藥提取試劑為乙腈，而后提取液經(jīng)旋干、丙酮定容后待上儀器測定，該方法具有普適性。但由于對提取液的凈化效率較為低下，更適合樣品本底較少、背景較為干凈的樣品，而對一些提取液顏色深或本底成份復(fù)雜的樣品不適用。主要體現(xiàn)在這些樣品在進(jìn)樣時造成了對檢測設(shè)備的極大污染，以致儀器靈敏度下降，特別是對一些極性較強(qiáng)的有機(jī)磷如甲胺磷、久效磷、氧化樂果等下降幅度更大，這樣不僅增大了方法的檢出限，還會對儀器部件如進(jìn)樣口配件、色譜柱等造成極大損耗，甚至縮短儀器壽命[4]。

鑒于此，有人通過改變提取液極性或增加凈化步驟來加以改善。歐陽蒲月[5]等采用二氯甲烷、丙酮混合提取液提取蔬菜中有機(jī)磷；宋國新[6]采用混合提取液，由乙腈25%、丙酮25%、乙醚25%、二氯甲烷25%按體積百分比組成，在后續(xù)試驗中增加了氨基柱凈化步驟并引入甲苯作為洗脫液提取測定豇豆中農(nóng)藥殘留。Huang[7]等采用凝膠滲透色譜法及固相萃取法提取茶葉中多種有機(jī)磷農(nóng)藥。這些改進(jìn)均對NY/T 761-2008 進(jìn)行了延伸和拓展，使有機(jī)磷檢測技術(shù)得到了極大提升。但這些改進(jìn)方案，如混合提取液雖能提高各種農(nóng)藥的提取效率，但同時也增加了對非目標(biāo)物的提取量，而這些非目標(biāo)物必然是檢測方法的累贅。各種固相萃取凈化小柱的應(yīng)用勢必額外增加有機(jī)試劑的用量，增加對環(huán)境的污染，同時增加方法應(yīng)用步驟，增大檢測勞動量。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)一種多功能的免疫親和柱（MycoSep 226 AflaZon+）可直接應(yīng)用于水果、蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測中凈化有機(jī)磷的乙腈提取液。免疫親和柱是一種特殊的SPE 柱，以極性、非極性及離子交換等幾類基團(tuán)組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，現(xiàn)主要被用于黃曲霉毒素含量測定的前處理凈化過程中[8-9]。應(yīng)用該柱對果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留提取液進(jìn)行凈化處理，可有效去除脂類、蛋白類等雜質(zhì)，有機(jī)磷農(nóng)藥則可順利通過。該方法凈化速度快，省時省力，有望在今后農(nóng)藥殘留測定中廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用楊梅Myrica rubra，黃瓜Cucumis sativus，辣椒Capsicum annuum鮮樣各5 kg，均來源于浙江省杭州市西湖區(qū)留下鎮(zhèn)世紀(jì)聯(lián)華超市。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

儀器設(shè)備：氣相色譜儀（Agilent 6890N）配火焰光度檢測器（FPD），HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，磨樣機(jī)（九陽 JYL-C022E），高速分散機(jī)(IKA T18 basic)，免疫親和柱（MycoSep 226 AflaZon+），具塞量筒（100 mL），計時器。

試劑：乙腈（分析純），氯化鈉（分析純），丙酮（優(yōu)級純），有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（上海安譜科技有限公司）：敵敵畏、丙溴磷、乙酰甲胺磷、治螟磷、甲拌磷、氧化樂果、二嗪磷、久效磷、除線磷、樂果、皮蠅磷、對硫磷、倍硫磷、異柳磷、水胺硫磷、喹硫磷、殺撲磷、乙硫磷、硫環(huán)磷，濃度均為1 000 μg·mL-1，使用時用丙酮將其配制成相應(yīng)濃度混表。

1.3 色譜條件

1.4 樣品制備及提取、凈化

用磨樣機(jī)將樣品鮮樣粉碎，稱取25.00 g 至150 mL 燒杯中，加入50 mL 乙腈，在高度分散機(jī)上分散萃取2 min（10 000 r·min-1），過濾，將濾液收集到裝有7 g NaCl 的10 mL 具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min 后，靜止30 min，吸取上清液過免疫親和柱凈化，收集凈化液0.5 mL 于進(jìn)樣瓶中，待測。

1.5 不同凈化處理方式處理結(jié)果比較

分別向3 種樣品中添加含量為0.2 mg·kg-1濃度的上述混合標(biāo)樣，按照NY/T 761-2008 中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留前處理的凈化方式和過免疫親和柱凈化方式對樣品進(jìn)行前處理，以目標(biāo)物的檢出限高低、對儀器的污染程度及處理時間作為評價依據(jù)，對其凈化處理效果進(jìn)行比較。

1.6 精密度與檢出限

分別在楊梅、黃瓜、辣椒樣品中添加濃度為0.02 mg·kg-1，0.05 mg·kg-1，0.10 mg·kg-1有機(jī)磷農(nóng)藥混標(biāo)，按照1.4，1.3 的方法進(jìn)提取、檢測，測定其精密度檢出限，各處理均6 次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel97-2003 軟件進(jìn)行分析處理數(shù)據(jù)，安捷倫氣相色譜工作站Chemistation 軟件生成圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)曲線繪制

用楊梅基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.02～ 1.00 mg·L-1的標(biāo)液在優(yōu)化選擇的色譜條件下進(jìn)行分析，獲得混標(biāo)色譜圖，如圖1。圖1 中，19 種濃度為0.10 mg L-1的混合標(biāo)液色譜圖，譜圖基線平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾小，不影響目標(biāo)物定性分析。以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1），各種有機(jī)磷農(nóng)藥在該范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999。黃瓜、辣椒的校準(zhǔn)曲線與之相近。

圖1 濃度為0.10 mg·L-1 的19 種混合標(biāo)樣色譜圖Figure 1 Chromatograms of 19 mixed standard solution with concentration of 0.10 mg·L-1

表1 19 種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear range,regression equation and correlation coefficient of 19 organophosphorus pesticides

2.2 不同凈化處理方式結(jié)果比較

分別向三種樣品中添加含量為0.20 mg·kg-1濃度的上述混合標(biāo)樣，按照NY/T 761-2008 中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留前處理的凈化方式和過免疫親和柱凈化方式對樣品進(jìn)行前處理，以目標(biāo)物的檢出限高低、對儀器的污染程度及處理時間作為評價依據(jù)，對其凈化處理效果進(jìn)行比較。各處理測定結(jié)果如表2。由表2 可知，所有農(nóng)藥的平均含量為0.18 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)差為0.002 7 mg·kg-1，免疫親和柱處理的則為0.19 mg·kg-1，0.001 6 mg·kg-1。經(jīng)NY/T 761-2008 的處理的3 種樣品經(jīng)過20 次進(jìn)樣后色譜儀中進(jìn)樣隔墊、襯管、分流平板等均有明顯污漬，色譜柱接進(jìn)樣口端色澤變化明顯，且目標(biāo)峰峰高呈逐漸縮小趨勢，而采用免疫親和柱處理的樣品則無這些現(xiàn)象。NY/T 761-2008 的凈化處理過程約2 h，而免疫親和柱的則只需要1 min。可見采用免疫親和柱對果蔬中有機(jī)磷殘留測定進(jìn)行凈化處理效果及測定結(jié)果準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于NY/T 761-2008，而且平行性良好，既省時省力，又能夠有效保護(hù)檢測設(shè)備。

表2 不同凈化方式樣品進(jìn)樣20 次的測定結(jié)果Table 2 Result of 20 tests on samples purified by different methods

2.3 精密度與檢出限

分別在楊梅、黃瓜、辣椒樣品中添加濃度為0.02 mg·kg-1，0.05 mg·kg-1，0.10 mg·kg-1有機(jī)磷農(nóng)藥混標(biāo)，按照1.4，1.3 的方法進(jìn)提取、檢測，測定其精密度、檢出限，各處理均6 次重復(fù)。

表3 19 種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限及精密度Table 3 Detection limit and precision of 19 organophosphorus pesticides

根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度值并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以此考察方法的精密度。19 種有機(jī)磷農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.6%～ 4.8%，檢出限均在0.01 mg·kg-1以下，如表3。由表3 可知，實(shí)驗中低濃度添加水平（0.02 mg·kg-1）回收率在85.4%～ 96.1%，中濃度（0.05 mg·kg-1）在89.7%～ 97.1%，高濃度（0.10 mg·kg-1）在90.2%～ 103%，總體回收率均在85%以上，可滿足當(dāng)前果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測定要求。

3 結(jié)論與討論

在NY/T 761-2008 標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，本試驗采用多功能免疫親和柱對有果蔬中機(jī)磷農(nóng)藥提取液進(jìn)行凈化，建立了一種可快速凈化果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法。19 種有機(jī)磷農(nóng)藥不同濃度回收率中，低濃度添加水平（0.02 mg·kg-1）回收率在85.4%～ 96.1%，中濃度（0.05 mg·kg-1）在89.7%～ 97.1%，高濃度（0.10 mg·kg-1）在90.2%～103%，總體回收率均在85%以上，RSD 在1.6%～ 4.8%范圍內(nèi)，檢出限均在0.01 mg·kg-1以下，明顯優(yōu)于NY/T 761-2008 的規(guī)定方法。本方法凈化過程可在1 min 內(nèi)鐘完成，凈化液可直接用于測定，方便、快捷，并可明顯降低對檢測設(shè)備的污染程度，這與劉藝[10]等對宣木瓜中有機(jī)氯農(nóng)藥處理效果相近。可見，本方法可滿足當(dāng)前果蔬中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留測定要求，有望在今后農(nóng)藥殘留測定中廣泛應(yīng)用。