腺苷脫氨酶檢測對結(jié)核性腹膜炎的診斷價值

李靜 馬異峰 逄宇 王卓 王曉琳 封婧 仵倩紅

結(jié)核性腹膜炎(tuberculous peritonitis，TBP)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種慢性彌漫性腹膜感染，是一種常見的腹腔結(jié)核，多繼發(fā)于腹膜外結(jié)核，占肺外結(jié)核的12%[1-2]，且伴隨著腹腔結(jié)核的增加而呈增多趨勢[3-6]。但因其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣、缺乏特異性、多并發(fā)其他疾病，且無確定性實驗室檢測方法，易被漏診和誤診而延誤診治，故早期診斷TBP對有效治療和降低死亡率非常重要[7-8]。

傳統(tǒng)的細菌學(xué)和病理學(xué)檢測一直是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準，但因抗酸桿菌(AFB)涂片鏡檢陽性檢出率低、培養(yǎng)周期長、病理取材有創(chuàng)傷，故尋求新的快速、準確且高敏感度和高特異度的TBP診斷方法成為結(jié)核病檢測工作的重要目標(biāo)。盡管2013年GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測作為新型分子診斷技術(shù)被WHO推薦用于肺外結(jié)核的診斷[9]，但其對腹腔積液中結(jié)核分枝桿菌的檢出率仍然很低[10]；而腺苷脫氨酶(ADA)檢測已被大量研究證實對于結(jié)核性胸腔積液、腦脊液和心包積液等肺外標(biāo)本也具有較高的輔助診斷價值[10-11]，但對腹腔積液的研究報道卻很少。筆者通過分析AFB涂片、BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)”)、GeneXpert和ADA檢測對TBP的診斷效能，進一步評估腹腔積液行ADA不同截斷值對TBP的診斷價值。

資料和方法

一、研究對象

收集2016年1月至2018年12月陜西省結(jié)核病防治院和北京胸科醫(yī)院收治的203例疑似TBP患者腹腔積液標(biāo)本的實驗室檢測資料，納入同時采用抗酸桿菌金胺O染色涂片鏡檢(簡稱“AFB涂片”)、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和ADA檢測的119例疑似TBP患者，其中73例(61.3%)確診為TBP患者(TBP組)中，男36例(49.3%)、女37例(50.7%)；年齡范圍14～87歲，其中<25歲年齡組29例(39.7%)、25～歲年齡組17例(23.3%)、45～歲年齡組18例(24.7%)、65～87歲年齡組9例(12.3%)。46例(38.7%)確診為非結(jié)核性腹膜炎(非TBP組)患者，包括腺癌、鱗癌、低分化癌、結(jié)腸癌共計21例，肺結(jié)核并發(fā)非結(jié)核分枝桿菌病2例，急性血行播散性肺結(jié)核2例，繼發(fā)性肺結(jié)核3例，腸結(jié)核1例，結(jié)核性心包炎1例，結(jié)核性多漿膜腔積液6例，胸膜炎、腦膜炎共10例；其中男22例(47.8%)、女24例(52.2%)，年齡范圍19～85歲，其中<25歲年齡組4例(8.7%)、25～歲年齡組12例(26.1%)、45～歲年齡組17例(36.9%)、65～85歲年齡組13例(28.3%)。以臨床確診患者為標(biāo)準，評價AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GereXpert和ADA檢測的檢測效能。

二、診斷標(biāo)準[12-13]

1.疑似TBP診斷標(biāo)準：(1)中青年患者，有結(jié)核病病史，并發(fā)其他器官結(jié)核病且診斷證據(jù)確鑿；(2)原因不明發(fā)熱達2周以上，伴有腹痛、腹脹、腹瀉、腹腔積液、腹壁柔韌感或腹部腫塊；(3)腹腔積液為滲出性，以淋巴細胞為主，普通細菌培養(yǎng)陰性，ADA檢測明顯高于臨床參考范圍；(4)結(jié)核菌素皮膚試驗(TST)強陽性或γ干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay，IGRA)陽性；(5)腹部X線攝影或CT掃描發(fā)現(xiàn)腹膜增厚、腸系膜結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)增大、腸粘連等征象。符合以上臨床診斷標(biāo)準其中一項即為可疑TBP患者。

2.TBP確診標(biāo)準：腹腔積液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，或臨床診斷為疑似TBP患者經(jīng)試驗性抗結(jié)核藥物治療2～4周有效。

3.其他疾病診斷：參照《內(nèi)科學(xué)》和臨床診療路徑，結(jié)合臨床癥狀、實驗室檢測、影像學(xué)和病理學(xué)檢查，以及診斷性治療有效可確診。

三、主要試劑和儀器

抗酸染色試劑為自配金胺O染色試劑；BACTEC MGIT 960檢測系統(tǒng)所用的培養(yǎng)儀及試劑均由美國BD公司提供；GeneXpert檢測系統(tǒng)及配套試劑盒均購于美國Cepheid公司；腹腔積液ADA測定采用貝克曼AU 2700全自動生化分析儀及配套試劑檢測。

四、檢測方法

腹腔積液標(biāo)本按照無菌采集標(biāo)本的要求留取。

1.AFB涂片：嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[14]操作。將腹腔積液標(biāo)本靜置2～4 h，取沉淀部分約20～50 ml，3000×g離心20～30 min，取沉淀物涂片、干燥、抗酸染色鏡檢，按照檢驗規(guī)程報告結(jié)果。

2.MGIT 960培養(yǎng)：嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[14]操作。取2 ml腹腔積液標(biāo)本經(jīng)N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉法(NALC-NaOH，終濃度為1.5%)消化去污處理后，室溫靜置15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)中和(pH=6.8)后再3000×g離心15 min，棄上清，2 ml PBS緩沖液重懸沉淀物，取0.5 ml重懸液接種至MGIT 960培養(yǎng)管中，加入0.8 ml 營養(yǎng)添加劑(OADC)和雜菌抑制劑(PANTA)的混合液，嚴格按照說明書進行操作。將接種好的MGIT 960培養(yǎng)管放入MGIT 960系統(tǒng)中孵育，儀器對分枝桿菌的生長進行自動監(jiān)測。儀器報陽后采用結(jié)核分枝桿菌抗原檢測試劑盒(MPB64)進行結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定[15]。

3.GeneXpert檢測：嚴格按照說明書進行檢驗。將1 ml腹腔積液標(biāo)本與2 ml GeneXpert系統(tǒng)前處理液混合，室溫靜置15 min。將消化后的2 ml樣品用無菌吸管吸入GeneXpert系統(tǒng)測試盒中，上機檢測，約2 h報告結(jié)果。

4.ADA測定：吸取腹腔積液標(biāo)本2 ml，3000×g離心5 min，直接放入全自動生化儀進行檢測(酶比色法)，自動報告結(jié)果。正常參考范圍為40 U/L，本研究經(jīng)ROC曲線分析，確定在敏感度最大時的ADA測定值(31.45 U/L)為陽性臨界值，以高于31.45 U/L為陽性，低于31.45 U/L為陰性。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。以臨床確診患者為參考標(biāo)準，評價AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert和ADA測定的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值、符合率。組間率的比較采用χ2檢驗，ADA測定值的比較采用t檢驗，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以ROC曲線分析ADA檢測的最佳臨界值，以ROC曲線下面積(AUC)評估檢測效能，AUC值越大，說明檢測的診斷價值越大。當(dāng)AUC值接近0.50時表示檢測對診斷無臨床意義；AUC值為0.50～0.70時表示診斷準確度較低；AUC值為0.70～0.90時表示診斷準確度為中等；AUC值>0.90表示診斷準確度較高。

結(jié) 果

一、不同檢測方法對TBP的檢出情況

119例疑似TPB患者中，AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測疑似TBP患者的陽性檢出者均為TPB患者，陽性率分別為2.5% (3/119)、6.7% (8/119)、7.6% (9/119)，且MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測TBP有6例患者是一致的；而ADA檢測疑似TBP患者的陽性檢出率為58.8% (70/119)，但70例陽性檢出者中TBP患者63例、非TBP患者7例。且63例TBP患者中ADA分別檢出55例MGIT 960培養(yǎng)和54例GeneXpert檢測陰性患者。

二、AFB涂片、MGIT 960培養(yǎng)、GeneXpert、ADA檢測對TBP的檢測效能

119例疑似TPB患者中，以臨床確診患者為標(biāo)準，不同檢測方法及ADA測定對TBP的檢測效能見表1，ADA的敏感度高于其他3種檢測方法。對ADA測定值進行ROC曲線分析，顯示當(dāng)腹腔積液ADA陽性臨界值為31.45 U/L時，敏感度為86.3% (63/73)，特異度為84.8%，AUC曲線下最大面積為0.836，見圖1。

圖1 ADA測定診斷TBP的ROC曲線

表1 不同檢測方法對TBP的檢測效能

三、ADA測定對TBP患者的檢測價值

TBP組的ADA陽性檢出率(86.3%)、ADA的平均值水平[(67.66±8.59)U/L]均高于非TBP組[分別為15.2%,(17.34±2.76)U/L]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，具體見表2。

表2 ADA檢測結(jié)果對TBP患者和非TBP患者的檢測價值

討 論

TBP是由結(jié)核分枝桿菌引起的彌漫性腹膜感染，大多繼發(fā)于其他部位的結(jié)核病灶，包括腹腔病灶直接蔓延感染、血行感染，但臨床上多數(shù)患者無法找到原發(fā)病灶。TBP的診斷依賴于胸腔積液的病原學(xué)或病理學(xué)檢測，然而傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片鏡檢及培養(yǎng)陽性檢出率基本低至10%[16]，本研究中AFB涂片陽性檢出率為2.5%，MGIT 960培養(yǎng)為6.7%，與上述研究相符，不利于TBP的診斷；且由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的環(huán)境要求較高，傳統(tǒng)的L-J(羅氏)培養(yǎng)結(jié)果需45 d[17]，即使MGIT 960培養(yǎng)也至少需要2～3周[17-18]，均無法滿足臨床快速診治的需求。而GeneXpert作為新型分子診斷技術(shù)，其在肺外結(jié)核中的診斷價值已被多項研究評估[19-25]，認為應(yīng)用GeneXpert檢測胸腔積液、腦脊液、尿液及骨關(guān)節(jié)結(jié)核部位膿液標(biāo)本具有較高的敏感度和檢測方法的優(yōu)越性，被認為可用于肺外結(jié)核各種類型臨床標(biāo)本(如腦脊液和組織樣本)檢測的確證性診斷試驗，但由于其檢測效果不理想，臨床中很少將其用于檢測疑似TBP患者的腹腔積液[26-27]，故缺乏對腹腔積液標(biāo)本的評估。本研究119例疑似TBP患者的腹腔積液標(biāo)本，GeneXpert陽性檢出率很低，僅為7.6%，雖然稍高于AFB涂片和MGIT 960培養(yǎng)，但仍難以對TBP進行輔助診斷，分析原因可能為抗酸染色涂片需抗酸桿菌達到5×103～1×104個/ml的濃度才能檢測出陽性結(jié)果，而涂片樣本量一般難以達到檢測需求量；而MGIT 960培養(yǎng)對環(huán)境要求極高，前處理過程復(fù)雜、人為影響因素較多且最終加樣培養(yǎng)量僅有較低的500 μl載菌量，也難有較高的檢出率；GeneXpert雖操作過程簡單，但加樣量也只有1 ml，載菌量也較低[14]。另外，本研究中有2例培養(yǎng)陽性但GeneXpert陰性的結(jié)果，這可能與GeneXpert主要檢測的是結(jié)核分枝桿菌的DNA，而MGIT 960培養(yǎng)主要檢測活的結(jié)核分枝桿菌，且MGIT 960培養(yǎng)與GeneXpert的細菌濃度陽性閾值檢測限也不相同(前者為100個/ml，后者為131個/ml)。同時結(jié)果還顯示，MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的檢測陽性者有6例為同時陽性，重疊比例較高。故認為目前不建議應(yīng)用GeneXpert檢測腹腔積液，更無需進行MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert的聯(lián)合檢測，如何高效應(yīng)用GeneXpert檢測腹腔積液標(biāo)本還需要進一步研究。

抗結(jié)核感染免疫仍主要依賴細胞免疫。結(jié)核分枝桿菌感染機體后激活單核巨噬細胞系統(tǒng)使巨噬細胞活化、淋巴細胞增殖、巨噬細胞胞體內(nèi)溶酶體酶大量增多，并產(chǎn)生非保護性抗體，對細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的殺傷力起到增強作用，故TBP是在腹膜感染結(jié)核分枝桿菌后而引起的一系列以淋巴細胞為免疫主導(dǎo)作用的變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，又常以腹腔積液為主要體征，故腹腔積液生物標(biāo)志物的檢測具有重要意義。ADA是嘌呤腺苷分解代謝過程中一種重要酶類，為特異性催化水解核苷生成肌苷核氨，在人體各器官組織中廣泛分布，尤其以淋巴細胞特別是T淋巴細胞中含量最高，且與T淋巴細胞分化程度呈正比。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激T淋巴細胞時，腹腔積液ADA活性增高[28]，故利用ADA測定可以反映結(jié)核分枝桿菌抗原的生化反應(yīng)，從而獲得結(jié)核分枝桿菌的載荷量，具有較高的診斷意義，被認為是診斷TBP較為特異的指標(biāo)，但陽性臨界值不同，其檢測的敏感度和特異度也不同，臨床上一般以ADA>40 U/L為陽性臨界值。一項Meta分析顯示，當(dāng)以ADA>40 U/L為陽性臨界值時，ADA診斷TBP的敏感度和特異度分別為93%和94%[29]；而Kang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以ADA>21 U/L 為最佳陽性臨界值時，其檢測特異度及敏感度分別為85%和92%；另外，Riquelme等[31]的Meta 分析報道，當(dāng)以36～40 U/L為臨界值時，ADA檢測的敏感度和特異度最高，分別為100%和97%。本研究對ADA測定值進行ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)以ADA>31.45 U/L為陽性臨界值時，檢測的敏感度和特異度分別為86.3%和84.8%，說明相較于GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)，腹腔積液標(biāo)本中ADA的測定對診斷TBP具有較高的敏感度，可以識別大約86.3%的TBP患者，提示其在TBP的診斷中有較高的診斷價值，但較上述研究結(jié)果低，可能與檢測ADA的儀器所設(shè)定的陽性界值不同、試劑來源不同、實驗方法不同而影響TBP的臨床診斷標(biāo)準，進而影響其檢測的敏感度和特異度；而且，臨床上有些TBP患者在檢測ADA時已進行診斷性抗結(jié)核藥物治療，使得腹腔積液中ADA水平有所降低，繼而影響其特異度。在臨床上TBP缺乏特異性臨床表現(xiàn)和體征，依據(jù)ADA水平的變化并結(jié)合抗結(jié)核藥物治療的效果可鑒別診斷TBP和其他疾病。本研究MGIT 960培養(yǎng)和GeneXpert檢測TBP陰性的患者中，ADA測定可檢出75.3% (55/73)和74.0% (54/73)的TBP患者，進一步說明ADA具有更好的檢測陽性反應(yīng)。

本研究也存在一定的局限性。其一，雖然納入了兩家醫(yī)院的患者，但是TBP患者樣本量仍然較小。其二，有研究表明，與HIV初發(fā)患者相比，HIV感染患者的ADA水平可能較低[32]，但考慮到我國目前HIV感染報告率還較低，本研究未納入HIV陽性患者進行研究。

綜上所述，ADA測定對TBP早期診斷具有較高的敏感度和特異度，GeneXpert檢測腹腔積液標(biāo)本的陽性率高于傳統(tǒng)的抗酸染色涂片鏡檢和培養(yǎng)，但因其檢測量只有1 ml，可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌荷菌量較低從而降低檢測敏感度。而ADA測定簡單快速，與常規(guī)生化檢測同時進行，當(dāng)天即可回報結(jié)果，適合所有開展常規(guī)生化檢測的基層單位開展，對患者的早期診斷，早期治療，避免不必要的檢查，節(jié)省大量醫(yī)療經(jīng)濟成本，降低漏診和死亡率意義重大。