蔓性千斤拔最佳采收期及根部總黃酮含量提取工藝研究

李楠 施力軍 陳彩姻 高麗霞

摘要：為研究蔓性千斤拔[Moghania philippinensis（Merr.Et Rolfe）Li.]的最佳采收期及根部總黃酮含量最佳提取工藝，采用紫外分光光度計(jì)法和L9（34）正交試驗(yàn)對其進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，蔓性千斤拔在次年10月總黃酮含量最高;在乙醇濃度90%、提取時間60 min、提取2次、提取溫度100 ℃時，根部總黃酮得率最高。

關(guān)鍵詞：蔓性千斤拔[Moghania philippinensis（Merr.Et Rolfe）Li.];最佳采收期;根部總黃酮含量;根部;提取工藝

中圖分類號：R284? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0143-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.034? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on the optimum harvest time of Moghania philippinensis and the

content of total flavonoids extraction technology in root

LI Nan1，SHI Li-jun2，CHEN Cai-yin1，GAO Li-xia1

（1.College of Chemical and Biological Engineering，Hechi University，Yizhou 546300，Guangxi，China;

2.Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning 530023，China）

Abstract： In order to study the best harvesting period of the genus Moghania philippinensis （Merr.Et Rolfe） Li. and the extraction process of the total flavonoids in the roots， the ultraviolet spectrophotometry and L9（34） orthogonal experimental were used to explore the best extraction technology of Moghania philippinensis. Results showed that the total flavonoid content of root was the highest in the October of next year， when ethanol concentration was 90%， extraction time was 60 min， extraction times was twice and extraction temperature was 100 ℃， the total flavonoid yield is the highest.

Key words： Flerningia philippinensis; the best harvest time; total flavonoid content of root; extraction process

蔓性千斤拔[Moghania philippinensis（Merr.Et Rolfe）Li.]，又稱為金雞落地、土黃芪、千斤拔、牛大力等[1，2]。作為藥食同源藥物，分布在中國華南地區(qū)及中南地區(qū)山坡草叢中，為豆科千斤拔屬（Flemingia Roxb.ex W.T.Ait.）多年生草本植物。千斤拔始載于《植物名實(shí)圖考》[3]，在《新華本草綱要》中已記載有10種千斤拔可以作為藥用植物[4]。目前，藥用價值較高的主要有5種，分別為蔓性千斤拔、大葉千斤拔、球穗千斤拔、腺毛千斤拔和寬葉千斤拔[5]，并多以干燥的根部作為藥用材料。蔓性千斤拔的主要藥用成分有黃酮、多糖和β-谷甾醇[6]，不僅能預(yù)防和治療呼吸系統(tǒng)功能障礙、心腦血管系統(tǒng)的遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥與貧血，而且還具有消炎殺菌、降低人體高血糖、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)功能[7]以及抗氧化、抗腫瘤作用[8，9];具體表現(xiàn)在止痛、預(yù)防血管形成血栓、治療肝臟腎臟虧虛及女性陰氣虧虛及由此引起的腰部和膝蓋的酸軟無力等癥狀[10]。在中醫(yī)里被列為益氣補(bǔ)血的上品，其性狀甘甜伴微苦澀，性味平，溫和無毒[10]，歸肝、腎經(jīng)[11]。用其粉末開水沖飲或泡酒飲用能夠舒筋骨活經(jīng)脈、緩解倦怠感[12]。

目前，對蔓性千斤拔總黃酮進(jìn)行提取的方法中，提取效率比較高且操作簡便的方法有水浸提法、微波輔助萃取法、超聲提取法等[13]。測定總黃酮含量的方法有比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法等[14]。近年來，蔓性千斤拔的市場需求量逐年攀升，加上人類濫采亂挖、對藥材過度利用，造成野生資源瀕臨滅絕。因此，現(xiàn)階段蔓性千斤拔在廣西已有較大規(guī)模的人工栽培，但種植戶為了收效快，對蔓性千斤拔急于采收，導(dǎo)致藥材中的有效成分遠(yuǎn)不達(dá)標(biāo)。因此，在采收過程中，既要保證其產(chǎn)量，同時也要保證其質(zhì)量（總黃酮含量高），需探明藥材的最佳采收期。本研究以廣西藥用植物園3號蔓性千斤拔為材料，研究其最佳提取工藝，通過綜合評價其單位面積產(chǎn)量及根部總黃酮含量探明其最佳采收期，并為相關(guān)企業(yè)提取蔓性千斤拔總黃酮工藝提供理論借鑒，以期達(dá)到提高蔓性千斤拔的種植效益和增加企業(yè)產(chǎn)值目的。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

所用材料均采收于廣西藥用植物園，為不同生長時期3號蔓性千斤拔的干燥根部，嚴(yán)格按照蔓性千斤拔種植標(biāo)準(zhǔn)在植株生長一年后，從2014年2月10日至2015年12月10日每間隔兩個月采收1次蔓性千斤拔樣品連續(xù)取樣12份（24個月）。

將采集的12份蔓性千斤拔根部清洗干凈后剪成每節(jié)2～4 cm，置于托盤放在室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干1周，然后于60 ℃烘箱干燥。充分干燥兩周后，按編號依次用40目篩粉碎機(jī)粉碎，按編號用封袋密封，放在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 蔓性千斤拔根部農(nóng)藝性狀測量? 蔓性千斤拔曬干，電子天平稱量，測其干重。測量其根長，距離須根1 cm處的直徑作為植株根粗標(biāo)準(zhǔn)，每組測量20株計(jì)算其平均數(shù)，烘干后計(jì)算其折干率。

1.2.2? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作? 研究表明，蘆丁溶液和蔓性千斤拔黃酮提取液吸收波長在460～510 nm，隨著波長的逐漸增加，蘆丁溶液和蔓性千斤拔黃酮提取液吸收波長也逐漸增加，在波長為510 nm處吸光度最大，而且當(dāng)吸收波長大于510 nm時，吸光度不會隨著波長的增加而增加，反而減少[15]。因此，本研究選擇510 nm作為蔓性千斤拔的最高吸收波長，蘆丁溶液和蔓性千斤拔黃酮提取液的吸光度均在510 nm的波長下測定。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度（A）作為縱坐標(biāo)，各種不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（C）為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁濃度與吸光度關(guān)系曲線的回歸方程為y=0.262 6x+0.009 3，R2=0.997 7。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

1.2.3? 蔓性千斤拔最佳提取工藝? 從12份蔓性千斤拔樣品各選取5 g蔓性千斤拔細(xì)粉于250 mL圓底燒瓶中。以乙醇為提取溶劑，對不同乙醇濃度（50%、70%、90%）、不同熱回流提取時間（30、60、90 min）、不同提取次數(shù)（2、3、4次）、不同提取溫度（60、80、100 ℃）4因素進(jìn)行考察，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，測定蔓性千斤拔的總黃酮含量以及蔓性千斤拔根部浸出物的含量，優(yōu)化蔓性千斤拔最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.4? 蔓性千斤拔提取液中總黃酮含量的測定? 吸取1.0 mL蔓性千斤拔提取液于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min后，加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min;再加入5%氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加入70%乙醇定容到10 mL，搖勻、靜置10 min，于510 nm波長處，以試劑空白為對照，測定吸光度。將所測得的吸光度代入回歸方程，求得提取液中總黃酮濃度，計(jì)算提取液中總黃酮得率。

提取液中總黃酮得率=（CV1/mV2）×50×10-3×100%。

式中，V1為定容后提取液的體積10 mL;V2為從母液中量取的提取液體積1.0 mL;C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL;m為蔓性千斤拔根的質(zhì)量，g。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同生長時期蔓性千斤拔產(chǎn)量性狀

2.1.1? 不同生長時期蔓性千斤拔根部產(chǎn)量性狀動態(tài)變化? 如圖2所示，蔓性千斤拔隨著生長時間的推移，其根部產(chǎn)量隨生長期的延長呈遞增走勢，4—8月根部產(chǎn)量增長比較快，10月至次年2月增長較為緩慢。

2.1.2? 不同生長時期蔓性千斤拔根長動態(tài)變化? 如圖3所示，蔓性千斤拔隨著生長時間的推移，其根長呈先快后慢的遞增趨勢，隨著蔓性千斤拔生長期的延長，根長生長變緩。兩年的觀察發(fā)現(xiàn)，蔓性千斤拔的根長伸長在第一年增加迅速，第二年進(jìn)入平緩增長期。

2.1.3? 不同生長時期蔓性千斤拔根粗動態(tài)變化? 如圖4所示，蔓性千斤拔隨著生長時間的推移，其根粗呈緩慢遞增趨勢，隨著蔓性千斤拔生長期延長根長生長變緩，并在第二年末進(jìn)入停滯期。從兩年的觀察結(jié)果來看，蔓性千斤拔的根粗增長在第一年比第二年生長速率快，第二年進(jìn)入生長平緩期，這與其根部產(chǎn)量的趨勢基本一致。

2.2? 蔓性千斤拔總黃酮最佳提取工藝的研究

提取總黃酮各因子正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。影響蔓性千斤拔提取的因素大小為A>D>B>C，即影響提取因素由高到低分別為乙醇濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)。

由表3方差分析結(jié)果可以看出，由于F=18.868，P=0.000<0.05，選取的4個因素影響總黃酮含量測定的比例均達(dá)到了89.3%，所以選取的4個因子是合理有效的。對試驗(yàn)結(jié)果的影響由高到低為乙醇濃度、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)。乙醇濃度對總黃酮提取量的影響達(dá)到極顯著，提取溫度對總黃酮提取量的影響顯著，提取時間和提取次數(shù)對總黃酮含量的影響不顯著。確定最佳組合條件為A3B3C1D3，即最佳工藝組合為90%乙醇濃度，提取時間90 min，提取次數(shù)2次，提取溫度100 ℃，在該工藝條件下總黃酮的提取效果最佳。

結(jié)合極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果可知，A因素和D因素為顯著因素，B因素和C因素為不顯著因素，即乙醇提取濃度和提取溫度對蔓性千斤拔的提取有顯著影響，提取時間和提取次數(shù)對蔓性千斤拔的提取影響不大，因此在生產(chǎn)上為了節(jié)約時間與經(jīng)濟(jì)成本，可以將最佳提取工藝為確定為A3B2C1D3，即最佳工藝組合為90%乙醇濃度，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，提取溫度100 ℃。

2.3? 不同生長期蔓性千斤拔總黃酮含量的測定

2.3.1? 不同生長期蔓性千斤拔總黃酮含量? 如圖5所示，蔓性千斤拔隨著生長期的延長，其根部總黃酮含量不斷增加，生長期與總黃酮含量呈S形遞增走勢。每年4—10月，其含量增長較快，10月至次年4月增長較為緩慢。

2.3.2? 不同生長時期蔓性千斤拔根部浸出物含量的測定? 如圖6所示，蔓性千斤拔隨著生長期的延長，其根部浸出物含量呈緩慢遞增趨勢。在每年4—12月根部產(chǎn)量增長較快，12月至次年4月增長較為緩慢。

2.3.3? 不同生長期蔓性千斤拔藥材質(zhì)量綜合評價? 為了能更好地綜合評價蔓性千斤拔最佳采收期，根據(jù)以根部總黃酮含量及產(chǎn)量的排名進(jìn)行累加，按名次高低進(jìn)行排序，結(jié)果如表4所示。綜合名次以2014年12月采收的總黃酮含量最高，但其與10月的差異不顯著，因此，蔓性千斤拔的最佳采收期應(yīng)在種植兩年半以上，其產(chǎn)量及質(zhì)量可達(dá)到最佳。

3? 小結(jié)與討論

3.1? 小結(jié)

蔓性千斤拔總黃酮最佳提取工藝組合為90%乙醇濃度，提取時間60 min，提取次數(shù)2次，提取溫度100 ℃。其根部總黃酮含量、根長及根粗隨生長期延長而增加。蔓性千斤拔的最佳采收期為次年的10月后，此期間采收的蔓性千斤拔藥材質(zhì)量最高。

3.2? 討論

乙醇加熱回流提取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于提取液處于相對封閉的環(huán)境中，受外界干擾少，最大程度地保留了蔓性千斤拔中的有效成分，提取效率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。同時，明確蔓性千斤拔的藥材最佳采收期，為蔓性千斤拔人工栽培提供較強(qiáng)的理論基礎(chǔ)。

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