響應面法優(yōu)化麻花艽中苦苷類成分提取工藝

姚 政,聶穎杰，王 怡,王 澤,林鵬程

(1.青海民族大學 藥學院，青海 西寧 810007；2.青海民族大學 青海省青藏高原植物資源化學研究重點實驗室,青海 西寧 810007；3.青海民族大學 青海省藥物分析重點實驗室，青海 西寧 810007)

麻花艽(GentianastramineaMaxim.)為龍膽科龍膽屬植物，在藏藥中名為“吉解嘎?！保湮缎?、苦，性平，入胃、肝、膽經(jīng)，具有祛風濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱的功效，用于風濕痹痛、中風、半身不遂、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、濕熱黃疸、骨蒸潮熱、小兒疳積發(fā)熱等[1-2].其主要的化學成分有龍膽苦苷、獐牙菜苷、異葒草苷等[3-4].現(xiàn)代藥理學研究表明，麻花艽有抗氧化、抗炎、抗過敏等作用[5-7].

近年來，在工藝優(yōu)化方面，對麻花艽苦苷類的研究多集中在龍膽苦苷[8-9]，未見有對龍膽苦苷和獐牙菜苷綜合的考察.我們在前人研究基礎上[10]，采用Box-Behnken中心組合試驗，通過響應面法優(yōu)化麻花艽地上部分中苦苷類成分(龍膽苦苷和獐牙菜苷)的提取工藝，確定了麻花艽地上部分中苦苷類成分的最佳提取工藝參數(shù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

FZ102微型粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，高效液相色譜儀(配置：手動進樣器，在線脫氣機，高壓二元梯度泵，恒溫柱溫箱，DAD檢測器，Agilent 1100色譜工作站).

1.2 材料

麻花艽地上部分于2017年8月采自青海省海南州同德縣，經(jīng)青海民族大學林鵬程教授鑒定為藏藥麻花艽(GentianastramineaMaxim.).將麻花艽地上部分陰干，粉碎，備用.

龍膽苦苷、獐牙菜苷標準品(HPLC歸一化法檢測，純度大于98%)；色譜甲醇(山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠)；水為超純水(優(yōu)普，ULUPURE).

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

取2.4 mg龍膽苦苷和2.9 mg獐牙菜苷標準品置于1 mL容量瓶中，用移液管吸取甲醇溶解并定容，得到標準品溶液濃度分別為2.4 mg/mL和2.9 mg/mL.

2.2 樣品溶液的制備

精確稱取麻花艽1.0 g，粉碎，加入10 mL的甲醇，超聲提取30 min，以5 mL的甲醇分兩次洗滌濾渣，過0.45 μm濾膜，濾液定容至25 mL.

2.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)柱.流動相：以水(含0.02% H3PO4)甲醇在0～10 min內(nèi)用20%的甲醇水溶液等度洗脫，20%～50%甲醇水溶液10 min～30 min.檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃.考查指標為兩者含量之和，混合對照品及麻花艽樣品色譜圖見圖1.

1：龍膽苦苷(gentiopicroside)，2：獐芽菜苷(sweorside)

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察

分別稱取龍膽苦苷、獐牙菜苷對照品，用色譜甲醇配制成含龍膽苦苷0.045 0 mg/mL、獐牙菜苷0.0084 mg/mL的混合標準對照品溶液，精確吸取混合標準對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL分別進樣，以各進樣量為橫坐標，各自的峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，回歸方程見表1.

表1對照品的線性方程及線性范圍

2.4.2 檢測限

在2.3色譜條件下，對各組分的最低檢測限進行測定，當信噪比是S/N=3 時，測得最低檢測限為：龍膽苦苷0.50 ng，獐牙菜苷0.84 ng.

2.4.3 精密度實驗

取2.4條件下的標準品溶液，在2.3色譜條件下進樣，每次10 μL，重復6次.測定色譜峰的峰面積，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為2.03%、2.68%.

2.4.4 重復性實驗

稱取麻花艽樣品0.5 g，共6份，在2.3色譜條件下進樣，每次10 μL，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷含量的RSD分別為1.58%、1.88%.

2.4.5 穩(wěn)定性實驗

精確稱取麻花艽樣品地上部分0.5 g，共6份，按2.2提取方法操作，分別在0、2、4、6、8 h時分別進樣，測定各色譜峰面積.通過計算龍膽苦苷、獐牙菜苷RSD 分別為0.75%、0.82%.表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.4.6 加標回收率實驗

稱取3份已測得含量的麻花艽地上部分樣品0.500 g，添加各對照品溶液適量，按2.2提取方法操作，測得龍膽苦苷的平均回收率(n= 3)為99.5%，獐牙菜苷平均回收率為103.2%；RSD分別為2.5%、3.0%.

2.5 提取工藝選擇

結合前期實驗的基礎及相關參考文獻[10]，將溫度設為68 ℃、料液比為1∶12、提取次數(shù)為3次，對提取工藝進行選擇.

2.5.1 提取溶劑對苦苷提取率的影響

稱取3份麻花艽地上部位樣品，每份0.5 g，分別以95%乙醇、50%乙醇、水為溶劑，各提取3次，熱回流法提取.料液比1∶20，每次0.5 h，合并提取液，濃縮后定容至50 mL.按2.3的HPLC條件進行實驗，測定上述龍膽苦苷和獐牙菜苷總含量.3種提取溶劑中，對苦苷提取率:95%乙醇(89.7%)>50%乙醇(86.1%)>水(81.7%).3個條件提取率相差不大.以水為提取溶劑簡便易行,成本低,因此提取溶劑選擇水.

2.5.2 提取方法對苦苷提取率的影響

稱取2份樣品，每份0.5 g，料液比1∶20，用超聲波提取、熱回流提取，每次0.5 h，提取3次.合并提取液，濃縮后定容至50 mL.按2.3的HPLC條件進行實驗,測定上述龍膽苦苷和獐牙菜苷總含量.兩種提取方法中，超聲法(82.8%)對苦苷總提取率最高，熱回流提取法(79.5%)和超聲波相差3.3%.相比于超聲波，在企業(yè)中熱回流設備普及率高，故選擇熱回流提取法.

3 結果與分析

3.1 響應面優(yōu)化麻花艽苦苷類成分提取工藝結果

表2響應面試驗因素及水平

3.2 響應面試驗結果

3.2.1 提取工藝對苦苷類成分含量的影響

以龍膽苦苷和獐牙菜苷的總量作為響應值R，實驗設計和結果見表3.

3.2.2 龍膽苦苷和獐牙菜苷總量響應值的方差分析

使用Design-Expert8.0.6軟件對龍膽苦苷和獐牙菜苷總量響應值進行二次多項式回歸擬合及方差分析，結果見表4.

表3響應面實驗設計方案與結果

表4 龍膽苦苷和獐牙菜苷總量響應值的方差分析表

由表4可知，對龍膽苦苷和獐牙菜苷總量回歸模型進行F檢驗，P值為0.001 4，說明模型極顯著；決定系數(shù)(R2)為0.986 9，修正后決定系數(shù)為0.963 4，說明實驗值與預測值之間具有相關性.對所建模型的擬合度進行失擬分析，其F值為0.086，P值為0.964 1，說明模型可準確預測相應變量.在所考察的獨立因素、因素間交互項及因素的二次項中，因素A、A2、C2為顯著影響因素，說明其對龍膽苦苷和獐牙菜苷總量提取效果的影響較大.通過方差分析得到的二次多項回歸方程R=-34.642+0.6863A+0.355B+3.742C+5.400×10-3AB- 1.7750×10-3AC+0.0159BC-5.2040×10-3A2-0.1281B2-0.1491C2.響應面3D曲面圖可以直觀地反映兩兩因素的交互作用及各因素對響應值的影響.各響應值的響應面3D圖譜見圖2.

由圖2可知，隨著各因素水平值的升高，龍膽苦苷和獐牙菜苷總量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但該趨勢在溫度的變化中表現(xiàn)更為顯著、料液比和提取次數(shù)影響較小.

圖2 溫度(A)、提取次數(shù)(B)、料液比(C)對龍膽苦苷和獐牙菜苷總量的響應面圖

在上述結果的基礎上，通過Design-Expert8.0.6軟件對麻花艽中龍膽苦苷和獐牙菜苷總量的提取工藝進行優(yōu)化，以龍膽苦苷和獐牙菜苷總量最高為指標，并在各因素的水平范圍內(nèi)選擇最佳參數(shù).最佳工藝為：提取溫度為65.68 ℃、料液比為1∶12.35、提取次數(shù)為3.54次，在此條件下龍膽苦苷和獐牙菜苷總量為11.636 mg/g.

3.2.3 提取工藝的優(yōu)化和驗證

對響應面優(yōu)化所得的龍膽苦苷和獐牙菜苷總量的提取工藝進行驗證.為方便操作，選擇提取溫度為66 ℃、料液比為1∶12、提取次數(shù)為3次，進行驗證試驗，測定龍膽苦苷和獐牙菜苷的總量為11.58 mg/g.在此工藝條件下，重復3次實驗測得龍膽苦苷和獐牙菜苷總量的實際含量的平均值為10.93 mg/g，與理論值比較接近，故采用Design-Expert8.0.6軟件設計得到的龍膽苦苷和獐牙菜苷總量的提取方法可靠，效果最佳.

4 結論

本研究運用響應面分析法對麻花艽樣品地上部位中苦苷類成分的提取工藝(溫度、料液比、提取次數(shù))進行考察，以龍膽苦苷和獐牙菜苷的總量為指標，得最佳提取工藝為提取溫度66 ℃、料液比1∶12、提取次數(shù)3次.在此優(yōu)化條件下，麻花艽樣品地上部位中龍膽苦苷和獐牙菜苷的總量為10.93 mg/g，并通過驗證實驗證明了麻花艽樣品地上部位中苦苷類成分提取工藝的可靠性和優(yōu)越性，表明藏藥麻花艽地上部位具有一定的藥用價值.該提取工藝可為藏藥麻花艽地上部位中苦苷類成分的提取提供一定的參考價值.同時，為藏藥麻花艽地上部位的綜合開發(fā)提供一定的理論依據(jù).