常見(jiàn)的熒光探針及其在活性氧檢測(cè)中的應(yīng)用

付艷華

摘 ?????要：熒光探針具有高靈敏度、高活性，在物質(zhì)成分測(cè)定及反應(yīng)進(jìn)程監(jiān)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。常見(jiàn)的熒光探針根據(jù)熒光團(tuán)的不同可以分為香豆素類(lèi)、氟硼熒染料、菁染料、萘酰亞胺類(lèi)、熒光素和羅丹明類(lèi)?；钚匝酰≧eactive Oxygen Species， ROS）與各種細(xì)胞過(guò)程有關(guān)，主要包括轉(zhuǎn)錄因子的激活、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和死亡。由于活性氧的壽命短、活性高，且會(huì)與蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)膜等迅速反應(yīng)，給其檢測(cè)工作帶來(lái)了困難。熒光探針作為一種高靈敏度的檢測(cè)方法，在活性氧的檢測(cè)工作中起到了重要作用。在介紹了不同熒光探針的基礎(chǔ)上，著重對(duì)檢測(cè)活性氧的熒光探針進(jìn)行了詳細(xì)的分類(lèi)與描述。

關(guān) ?鍵 ?詞：活性氧;熒光探針;熒光團(tuán)

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ422 ??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ??????文章編號(hào)： 1671-0460（2019）02-0384-04

Abstract： Fluorescent probes have high sensitivity and high activity， so they have been widely used in the monitoring of material composition and reaction process. Common fluorescence probes can be divided into coumarin， BODIPY， cyanine， naphthalimides， fluoresceins and rhodamines probes. Reactive oxygen species （ROS） are involved in various cell processes， including transcription factor activation， gene expression， cell proliferation and death. Due to the short life and high activity of reactive oxygen， it is easy to react with protein， DNA， lipid membrane and so on， so it is very difficult to detect ROS. As a high sensitive detection method， fluorescent probe plays an important role in the detection of ROS. In this paper， different fluorescent probes were introduced， especially the fluorescence probes for the detection of reactive oxygen species.

Key words： Reactive oxygen species; Fluorescent probe; Fluorophore

熒光是分子從激發(fā)單重態(tài)回到基態(tài)的過(guò)程中發(fā)射出的光，然而大多數(shù)的待測(cè)分子本身沒(méi)有熒光特性，而且在化學(xué)反應(yīng)的過(guò)程中，也很少能夠發(fā)出熒光。但是熒光探針可以通過(guò)與待測(cè)物發(fā)生物理作用或化學(xué)變化實(shí)現(xiàn)熒光的變化，這使得熒光探針成為一種檢測(cè)分子變化過(guò)程的工具[1]。熒光探針在探索生命活動(dòng)的規(guī)律、醫(yī)療器械的開(kāi)發(fā)、環(huán)境的檢測(cè)等方面具有良好的應(yīng)用前景[2]。

活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）在生物體內(nèi)廣泛存在，包括O2-、H2O2及HO·、1O2等，主要產(chǎn)生于線(xiàn)粒體電子傳遞過(guò)程。內(nèi)生的活性氧在生理過(guò)程中起著重要作用[3]，它不僅是多種細(xì)胞通路的組分，同時(shí)在細(xì)胞凋亡和自噬過(guò)程中起到重要作用[4]。但是，過(guò)量的活性氧會(huì)引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。如圖1所示。

常用的檢測(cè)ROS的方法是利用熒光探針2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFDA）標(biāo)記的熒光分光光度法和共聚焦熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)成像技術(shù)，而共聚焦熒光顯微鏡動(dòng)態(tài)成像技術(shù)可以觀(guān)察生物中重要的ROS，同時(shí)此方法還可以定量檢測(cè)某些活性氧[5，6]。這類(lèi)探針大都基于氧化還原反應(yīng)來(lái)顯示熒光變化。氧化還原探針是一種通過(guò)氧化還原反應(yīng)來(lái)改變熒光強(qiáng)度，使熒光“開(kāi)啟”或“關(guān)閉”的分子。近年來(lái)一些課題組致力于研究熒光探針在檢測(cè)生物體內(nèi)活性氧的應(yīng)用[7， 8]。

1 ?熒光探針?lè)诸?lèi)及簡(jiǎn)介

1.1 ?香豆素類(lèi)熒光探針

香豆素（Coumarin）是最早被發(fā)現(xiàn)且易于合成的熒光類(lèi)物質(zhì)之一。它們的激發(fā)波長(zhǎng)通常較短，如香豆素314（見(jiàn)圖2），吸收波長(zhǎng)為426 nm，因此，含有這種熒光團(tuán)的分子不能較好的應(yīng)用于細(xì)胞分析和成像，但是它們?cè)谠诿阜治鲋蟹浅Ｖ匾?，尤其是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）機(jī)制的酶抑制劑的研究很有價(jià)值。香豆素沒(méi)有很強(qiáng)的吸收，通常我們認(rèn)為≥80 000 M–1·cm–1時(shí)，是強(qiáng)吸收熒光團(tuán)，而香豆素的吸收約為24 200 M–1·cm–1，但是它有很好的光穩(wěn)定性，而且這類(lèi)物質(zhì)在分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移（ICT）機(jī)制中，通常有較大的斯托克斯位移，斯托克斯位移是指熒光體的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的差值，差值越大，自吸收現(xiàn)象越不易發(fā)生，能量損失越少[9]。

1.2 ?氟硼熒染料類(lèi)探針

氟硼熒染料（BODIPY）是一類(lèi)比較新的熒光物質(zhì)，它的出現(xiàn)時(shí)間要追溯到1968年。它們通常有較高的熒光量子產(chǎn)率，以及狹窄的吸收和發(fā)射譜線(xiàn)。因?yàn)樗鼈儎傂越Y(jié)構(gòu)較強(qiáng)，限制了吸收和發(fā)射譜線(xiàn)增寬的振動(dòng)狀態(tài)的密度，減少了激發(fā)態(tài)內(nèi)轉(zhuǎn)換（IC）的機(jī)率。但它的這種剛性結(jié)構(gòu)也導(dǎo)致其斯托克斯位移非常小，即使它是非常明亮的熒光團(tuán)，應(yīng)用也受到了一定的限制。氟硼熒染料主要應(yīng)用在光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）機(jī)制中，且有多個(gè)修飾位點(diǎn)（見(jiàn)圖3），所以有許多商品化的衍生物可以直接和生物分子結(jié)合。

例如：氟硼熒染料的衍生物和2，4-二硝基苯磺酰氯結(jié)合能夠區(qū)分谷胱氨肽和其他氨基酸[10]。

1.3 ?菁染料熒光探針

菁染料熒光探針有非常高的吸光系數(shù)，是目前已知最亮的熒光團(tuán)[11]，如Cy3，Cy5（見(jiàn)圖4）。菁染料熒光素是最早可發(fā)射紅外和近紅外波長(zhǎng)的染料，曾得到廣泛應(yīng)用。然而，該類(lèi)熒光探針存在兩個(gè)很大的缺點(diǎn)：首先，菁染料熒光探針極易被氧化，除了容易發(fā)生光氧化，該類(lèi)探針（如Cy5的衍生物）還極易與O2 及臭氧發(fā)生反應(yīng);其次，菁染料熒光探針的熒光量子產(chǎn)率通常比較低（?≤0.28）。這兩方面的限制使得該類(lèi)探針不適用于長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)[12]。

1.4 ?萘酰亞胺類(lèi)熒光探針

我們通常認(rèn)為萘酰亞胺類(lèi)和香豆素類(lèi)一樣，是具有短波長(zhǎng)、較大的斯托克斯位移的熒光分子[13]，如Lucifer Yellow CH（見(jiàn)圖5）吸收波長(zhǎng)為425 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm。這類(lèi)物質(zhì)的亮度比香豆素類(lèi)強(qiáng)、易合成和修飾、熒光特性穩(wěn)定、能很好的抵抗光漂白。

盡管它現(xiàn)在有較長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)的衍生物，發(fā)射波長(zhǎng)也在紅外或者近紅外波長(zhǎng)范圍，但這些衍生物目前尚未得到較好應(yīng)用。

1.5 ?熒光素和羅丹明熒光探針

熒光素和羅丹明的合成可以追溯到19世紀(jì)晚期，其中最具有代表性是熒光素和羅丹明B（見(jiàn)圖6）。該類(lèi)熒光探針的特點(diǎn)主要是熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，相關(guān)衍生物的發(fā)射波長(zhǎng)可以達(dá)到紅外或近紅外區(qū)域，但其也存在一定的缺陷。首先，熒光素和羅丹明衍生物的光穩(wěn)定性差，1 h的光照輻射就會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生明顯的光漂白;其次，該類(lèi)探針的合成收率低下，且純化困難。盡管如此，由于細(xì)胞滲透性、細(xì)胞定位和細(xì)胞內(nèi)聚集都非常依賴(lài)于這類(lèi)熒光團(tuán)的特定結(jié)構(gòu)，且它們有較大的斯托克斯位移，該類(lèi)探針被廣泛用于化學(xué)、生化、生物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[14， 15]。

2 ?各類(lèi)熒光探針在活性氧檢測(cè)研究中的應(yīng)用

2.1 ?香豆素類(lèi)熒光探針的應(yīng)用

硝?；℉NO）呈現(xiàn)弱酸性（pKa = 11.4），是一種與心臟保護(hù)有關(guān)的活性氧分子。雖然HNO的去質(zhì)子化過(guò)程（生成NO-）異常緩慢，但是NO-一旦生成，會(huì)與氧氣迅速反應(yīng)形成過(guò)氧亞硝基（OONO-）。對(duì)于該反應(yīng)過(guò)程，之前一直沒(méi)有明確的研究方法。Adam Sikora[16] 等利用香豆素類(lèi)熒光探針在水溶液中對(duì)HNO進(jìn)行定量檢測(cè)，為HNO和分子氧的反應(yīng)過(guò)程以及過(guò)氧亞硝基的形成提供了明確的依據(jù)。他們報(bào)道的7-硼酸香豆素a（見(jiàn)圖7）在磷酸鹽緩沖液中無(wú)熒光，在OONO-的加成，O-O鍵的異裂之后，產(chǎn)生了熒光物質(zhì)7-羥基香豆素b（見(jiàn)圖7）這一過(guò)程可以量化檢測(cè)過(guò)氧亞硝基。

2.2 ?氟硼熒染料類(lèi)探針的應(yīng)用

一氧化氮（NO）是一種常見(jiàn)的生物信使分子，并在各種生理調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著積極的作用。Wei Guo[17]等利用氟硼熒染料類(lèi)探針，首次基于PET機(jī)制利用富電子芳香二次胺的亞硝化反應(yīng)，構(gòu)造出了反應(yīng)快，選擇性高，靈敏度高熒光探針c1，c2（見(jiàn)圖8）對(duì)NO進(jìn)行檢測(cè)。在探針c1、c2中，N-芐基-4-羥基苯胺基是供電子基團(tuán)，而B(niǎo)ODIPY的8位是缺電子結(jié)構(gòu)，由此帶來(lái)的電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致N-芐基-4-羥基苯胺基的電子云密度降低?；谝陨螾ET機(jī)制，c1、c2發(fā)生熒光淬滅。但是當(dāng)c1、c2與NO反應(yīng)后生成，N-芐基-4-羥基苯胺基上連接NO之后，電子云密度降低，不再發(fā)生熒光淬滅，d1、d2產(chǎn)生非常明顯的綠色熒光。

2.3 ?菁染料熒光探針的應(yīng)用

過(guò)氧亞硝基（ONOO-）在生物體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，對(duì)體內(nèi)平衡調(diào)節(jié)和氧化損傷的研究有重要意義。菁染料熒光探針具有獨(dú)特的生物氧化-還原循環(huán)結(jié)構(gòu)。Keli Han[18]等基于氧化還原機(jī)制，利用菁染料熒光探針e（見(jiàn)圖9）對(duì)ONOO-進(jìn)行了可逆監(jiān)測(cè)。硒（Se）通常作為抗氧化酶的活性位點(diǎn)，在這一探針中可以調(diào)節(jié)ONOO-水平，同時(shí)谷胱甘肽（GSH）通過(guò)可逆的過(guò)程來(lái)還原ONOO-，即該探針中含有的有機(jī)硒可用于可逆的過(guò)氧亞硝酸鹽的檢測(cè)。該探針基于PET機(jī)制導(dǎo)致熒光淬滅，但在ONOO-氧化作用下，產(chǎn)生SeO這一吸電子基團(tuán)，基于SeO的推拉電子效應(yīng)（ICT），熒光光譜發(fā)生藍(lán)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了23.3倍。

2.4 ?萘酰亞胺類(lèi)熒光探針的應(yīng)用

Peng等[19]報(bào)道了一種基于非氧化還原機(jī)制的檢測(cè)氧自由基的比率熒光探針g（圖10）。探針由二苯基膦酸鹽基（活性氧的觸發(fā)點(diǎn)），三苯基膦（使探針到達(dá)線(xiàn)粒體），氨基甲酸酯與1、8-萘酰亞胺相連（吸電子基團(tuán)）組成。這一探針的熒光變化是基于ICT效應(yīng)的變化來(lái)改變的。在探針g中加入氧自由基后，產(chǎn)生綠色熒光產(chǎn)物h（見(jiàn)圖10），在供電子基團(tuán)不變的情況下，產(chǎn)物h中吸電子效應(yīng)較探針g減弱，導(dǎo)致推-拉電子效應(yīng)（ICT效應(yīng)）增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)紅移，最大吸收波長(zhǎng)從375 nm移至431 nm，同時(shí)熒光發(fā)射波長(zhǎng)從475 nm紅移至540 nm，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了18倍。

2.5 ?熒光素和羅丹明熒光探針的應(yīng)用

楊丹課題組[20]報(bào)道了基于氧化還原機(jī)制的熒光素類(lèi)探針i（見(jiàn)圖11），該探針可以定量檢測(cè)HOCl，且特異性強(qiáng)，靈敏度高。該探針中由于鄰氯取代基的作用，將苯酚的pKa從10.0（不含氯取代）降低至6.79，氯代苯酚的電子云密度增高，通過(guò)PET機(jī)制淬滅熒光。探針中富電子的氯代苯酚親核性很強(qiáng)，與HOCl反應(yīng)，生成氧化產(chǎn)物j（見(jiàn)圖11）。

同時(shí)氯代苯酚氧化脫去，PET機(jī)制消失，熒光增強(qiáng)約358倍。

3 ?結(jié)束語(yǔ)

過(guò)去20年中，基于不同的機(jī)制和熒光團(tuán)，熒光探針在活性氧檢測(cè)方面的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用取得很大的進(jìn)展。但是還有許多問(wèn)題亟待解決，比如光穩(wěn)定性差，選擇性低等。構(gòu)建更為快捷、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)探針，并將其應(yīng)用于生物、環(huán)境、醫(yī)療、食品各個(gè)領(lǐng)域中，將是我國(guó)對(duì)熒光探針研究和探索的重要方向。

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