牛結(jié)節(jié)性皮膚病ELISA檢測試劑盒驗證試驗

薛文 蘇曉慧 秦菊 努爾麥麥提·阿穆提 居馬別克·夏拉巴依 王文

摘 要 2019年8月12日，經(jīng)國家外來動物疫病研究中心檢測，確診新疆伊犁州發(fā)生牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情，這是新疆首次發(fā)現(xiàn)該病。疫情確診后，對病牛所在縣及其相鄰縣全部牛只進行緊急免疫山羊痘疫苗。為了了解免疫后抗體水平，驗證檢測試劑盒特異性，選取3個規(guī)?；黾?個規(guī)?；驁?，采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法，對76份牛血清樣本和36份羊血清樣本進行了檢測。結(jié)果顯示，測試的雙抗原ELISA檢測試劑盒，可以檢測到16份牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒感染抗體和21份山羊痘病毒免疫抗體，未能檢出山羊痘免疫牛血清中相關抗體。

關鍵詞 牛結(jié)節(jié)性皮膚?。豢贵w檢測；免疫抗體；LSDV 特異性抗體

2019年8月3日，新疆伊犁哈薩克自治州報告在伊犁察布查爾縣瓊博拉鎮(zhèn)入戶排查時，發(fā)現(xiàn)部分牛養(yǎng)殖戶有1-2頭發(fā)病，患牛皮膚出現(xiàn)廣泛性結(jié)節(jié)（疙瘩）、流鼻涕、流涎、食欲減退及發(fā)燒等臨床癥狀，初步診斷為疑似牛結(jié)節(jié)性皮膚?。↙SD）。疫情確診后，采用國家批準的山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量），對病牛所在縣及其相鄰縣全部牛只進行緊急免疫。為了驗證檢測試劑盒特異性，選取46份LSDV感染牛血清，66份免疫血清樣本（36份羊血清，30份牛血清），采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法對血清樣本進行了檢測，為做好LSD防控提供一些數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 分組及樣品采集

1.1.1 感染組（牛結(jié)節(jié)性皮膚病感染抗體檢測）。在伊犁州霍城縣某發(fā)病牛場采集感染LSDV牛血清24份，在伊犁州察縣某發(fā)病牛場采集感染LSDV牛血清22份。

1.1.2 試驗羊組（山羊痘免疫抗體檢測）。選自新疆昌吉州奇臺縣某規(guī)模羊場，選取整群綿羊36只，采用皮內(nèi)注射進行山羊痘疫苗第1次免疫，疫苗免疫40天后采集血樣。

1.1.3 試驗牛組（牛免疫山羊痘抗體檢測）。選自新疆伊犁州察縣1個鄉(xiāng)鎮(zhèn)規(guī)?；B(yǎng)殖場選取30頭，采用皮內(nèi)注射進行山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量免疫）第1次免疫，疫苗免疫30天后，采集血樣。

1.2 疫苗及檢測試劑

疫苗來源來自政府統(tǒng)一招標采購的山羊痘疫苗。

診斷試劑 羊痘屬抗體檢測試劑盒購自法國ID.VET公司，生產(chǎn)批號F05。

1.3 檢測方法

采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法，以羊痘病毒純化抗原作為包被抗原，檢測牛、綿羊、山羊和其它敏感物種血清中的羊痘病毒、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒、綿羊痘病毒、山羊痘病毒抗體。

1.4 儀器設備

全波長酶標儀（Thermo）、高速自動化清洗酶標板（瑞士帝肯）、微量移液器等。

2 結(jié)果

2.1 感染組

共檢測2個場點的46份牛血清樣品，檢出抗體陽性16份。

2.2 試驗羊組

共檢測1個場點的36份羊血清樣品，檢出抗體陽性21份。

2.3 試驗牛組

共檢測1個場點的30份牛血清樣品，檢出抗體陽性0份。

3 討論和建議

此次牛結(jié)節(jié)性皮膚病疫情為新疆首例。通過采取“免疫+改良捕殺”的防控策略，即在伊犁地區(qū)緊急免疫山羊痘疫苗（按照山羊的5倍劑量免疫），同時采取僅對發(fā)病牛進行捕殺的政策，限制動物移動。由于天氣轉(zhuǎn)冷蚊蟲等傳播媒介減少，LSD疫情呈明顯的季節(jié)性[1]。該疫情已得到有效控制。通過入戶排查結(jié)合熒光PCR試驗檢測，未發(fā)現(xiàn)新增LSD病例。

本次檢測用的雙抗原ELISA檢測試劑盒，未能檢出山羊痘免疫牛只血清中相關抗體。這可能是由于山羊痘疫苗為弱毒苗，主要是細胞介導，可在短時間內(nèi)發(fā)生免疫作用，但抗體產(chǎn)生的滴度水平低。有報道顯示，首次免疫山羊痘活疫苗產(chǎn)生的抗體滴度不均，14-21天達到抗體水平峰值，51天左右出現(xiàn)免疫空擋，且免疫后期抗體滴度水平較低[2]，這與疫苗種類、畜禽機體、飼養(yǎng)管理等影響較大[3]。另一方面，山羊痘僅免疫牛只一次，產(chǎn)生抗體的滴度低，尤其是對輕度和持續(xù)期較長的LSDV感染，使用ELISA方法檢測抗體水平來評價疫苗免疫效果不佳。此外，皮內(nèi)操作困難，容易注入肌肉，造成免疫效果不確實或免疫失敗[4]。

根據(jù)檢測結(jié)果，可以檢測到牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒感染抗體和山羊痘病毒免疫抗體，現(xiàn)階段該試劑盒可作為牛結(jié)節(jié)性皮膚病發(fā)病早期的血清學診斷方法和山羊痘免疫羊后抗體的檢測方法。建議首免21天后加強免疫一次，再進行抗體測定；同時采用中和試驗結(jié)合臨床觀察結(jié)果確認評價疫苗免疫保護效果。

參考文獻：

[1]袁麗萍，宋建德.2015-2016年歐洲牛結(jié)節(jié)性皮膚病流行狀況分析[J].中國動物檢疫，2017，34（8）：32-35.

[2]劉忠偉.山羊痘疫苗免疫保護能力試驗[D].貴州：貴州大學，2006：1-70

[3]程國奎，于建文，柴紹芳。山羊痘疫苗抗體時效性研究與探索[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2017，36（5）：56-57

[4]趙燕，柴紹芳，郭憲.山羊痘病毒的血清學檢測與PCR鑒定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2018，37，（3）：63-64

第一作者：薛文（1987-），女，漢族，河南正陽，本科學歷，助理獸醫(yī)師，從事病毒性人獸共患病研究。

通訊作者：王文（1968-），女，農(nóng)業(yè)推廣研究員，從事動物疫病監(jiān)測和防控技術的研究。