原油降解菌的篩選及降油率比較

鄭建芳 周飛 劉喬

摘 ?????要：經(jīng)牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基馴化、固體培養(yǎng)基分離純化，從長慶油田措施廢液集中處理后殘渣中篩選出了5株具有較強降解石油能力的微生物菌株，將其分別編號為D1、D2、D3、D4、D5。通過形態(tài)學(xué)和生理生化實驗對分離得到的純種菌株進行鑒定，結(jié)果表明D1屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.） ，D2屬于鏈球菌屬（Streptococcus sp.） ，D3屬于黃桿菌屬（Flavobacterium Bergey sp.） ，D4屬于微球菌屬（Micrococcus Cohn sp.） ，D5屬于產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes sp.）。將得到的5株純菌株在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，分別按單株菌株5 mL、2種菌株以1：1的比例各5 mL、3種菌株以1：1：1的比例各5 mL的接種量，分別接種到原油液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d后，按照《CJ/T 57-1999》標(biāo)準(zhǔn)測定原油降解率。比較原油降油率，得到2種菌株組合接種的降油率高于3種菌株組合高于單菌菌株。其中D1、D4按照1：1比例，各5 mL的接種量接種到原油液體培養(yǎng)基中得到的降油率最高，為89.39%。

關(guān) ?鍵 ?詞：分離純化;菌株鑒定;降油率;菌株組合

中圖分類號：X53 ????文獻標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）02-0256-05

Abstract： Through cultivation and acclimation in the beef paste peptone liquid culture medium， separation and purification， 5 strains of microorganisms with strong petroleum degradation capacity were selected from the residue after concentrated treatment of Changqing oilfield wastewater， and they were numbered as D1 ， D2， ， D3， D4， D5. The isolated strains were identified by morphology and physiological and biochemical tests. The results showed that D1 belonged to Bacillus sp.， D2 belonged to Streptococcus sp.， and D3 belonged to Flavobacterium sp.， D4 belongs to Micrococcus Cohn sp. and D5 belongs to Alcaligenes sp. The obtained 5 strains of pure strain were cultured for 3 days in the beef paste peptone liquid culture medium. 5 mL of each strain， two strains of each strain at 1：1 ratio of 5 mL， and three strains at 1：1：1 ratio of 5 mL were inoculated in crude oil liquid medium. After 7 days， the degradation rate of crude oil was measured according to "CJ/T 57-1999" standard. Comparing the crude oil degrading rate， the oil degradation rate of the 2 strains inoculated was higher than that of the 3 strains， and was also higher than that of the single strain. Among them， the oil degradation rate of D1 and D4 inoculated into crude oil liquid medium in the ratio of 1：1 and the inoculation amount of each 5 mL was the highest， 89.39%.

Key words： Separation and purification; Strain identification; Oil degradation rate; Strain combination

石油原油是成分復(fù)雜難于降解的碳?xì)浠衔铮喾N致癌、致畸、致突變的化學(xué)物質(zhì)[1]，甚至干擾人體酶系統(tǒng)，導(dǎo)致腎、肝等內(nèi)臟病變[2] 。近年來，石油泄露、含油廢棄物的排放等造成的土壤污染問題日益嚴(yán)重[3]。因此，治理石油污染勢在必行。

目前，含油污泥處理主要有化學(xué)處理法、物理處理法和生物處理法?；瘜W(xué)處理法可分為溶液淋洗萃取法[4]、電化學(xué)法和化學(xué)氧化法等[5，6]，整體來講化學(xué)處理法雖然處理效率高，但成本高且產(chǎn)生二次污染。物理處理法僅降低含油污泥濃度，無法徹底去除污染物[7，8]。對比化學(xué)法與物理法，微生物法修復(fù)石油污染土壤具有成本低、效果好以及二次污染小等優(yōu)點[1]。因此，人們將注意力轉(zhuǎn)向生物法治理石油污染土壤，通過改變生物外部生活環(huán)境和依照生物自身的遺傳變異規(guī)律提高石油降解速度和程度[9-11]，此種方法具有手段多樣化、降解程度高、代謝旺盛且代謝物無毒害[12]的特點，被認(rèn)為是生態(tài)環(huán)境保護領(lǐng)域最有價值、最有前途的和對土壤修復(fù)較為徹底的污染修復(fù)技術(shù)[13，14]。目前，在石油降解菌的篩選及降解特性研究方面取得了諸多進展[1]，姚瑤、鄭青松對2株石油降解菌DH-5 和DH-9 生長的最適培養(yǎng)基成分以及降解石油的最佳環(huán)境條件進行了篩選。研究結(jié)果表明，DH-9 對高濃度原油的耐受性明顯強于DH-5，而DH-5 對低溫的適應(yīng)性優(yōu)于DH-9，2個菌株對高鹽度的適應(yīng)性均較強[15]。為了獲取對環(huán)境無毒害作用且能高效降解石油的菌株，最大限度地提高油污土壤的修復(fù)程度，現(xiàn)從長慶油田措施廢液集中處理后的殘渣中篩選出了5株具有較強降解石油原油的微生物菌株，并對其進行了菌株鑒定，菌株生長曲線與生長過程中pH值變化的測定，以及單株菌株、2種菌株組合與3種菌株組合對原油降解效果的比較。

1 ?材料與方法

1.1 ?實驗材料

1.1.1 ?試劑及樣品

硫酸鎂（MgSO4·7H2O，分析純），磷酸氫二鉀（K2HPO4，分析純），硝酸銨（NH4NO3，分析純），磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純），氯化鈣（CaCl2·7H2O，分析純）;硫酸鐵（FeSO4·7H20，分析純），氯化鈉（NaCl，分析純），乙二胺四乙酸（EDTA，分析純），瓊脂（生化試劑），牛肉膏（生化試劑），蛋白胨（生化試劑），石油醚（N/A，60～90 ℃，分析純），無水硫酸鈉（Na2SO4，分析純）。

措施廢液集中處理后的殘渣：（長慶油田污水處理站，樣品名稱：地244-70）;原油（長慶油田措施廢液集中處理后殘渣無害化處置項目組）。

1.1.2 ?培養(yǎng)基的制備

微量元素培養(yǎng)基[16]：K2HPO4 4.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4NO3 4.0 g，KH2PO4 6.0 g，微量元素溶液1 mL（CaCl2·7H2O 1.0 g，F(xiàn)eSO4·7H20 1.0 g），EDTA 1.4 g，去離子水1.0 L。

原油液體培養(yǎng)基：在微量元素培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入0.5%原油。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂即可制得。

1.1.3 ?主要儀器

DGF-1AB型電熱干燥箱 天津泰斯特儀器公司，LSHZ-300 數(shù)顯冷凍水浴振蕩器 太倉實驗設(shè)備廠，DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海東麓儀器設(shè)備有限公司，光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器六廠，722可見分光光度計 杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司，AG-285型電子分析天平 梅特勒公司。

1.2 ?實驗方法

1.2.1 ?石油降解菌株分離純化

準(zhǔn)確稱取10 g樣品，加至90 mL已滅菌的生理鹽水中，放在165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上培養(yǎng)。12 h后取出，用移液槍吸取1 mL上清液于一支滅過菌裝有9 mL去離子水的試管中，給試管標(biāo)號1?；蝿?號試管，使試管中液體混合均勻，用換過槍頭的移液槍吸取1 mL液體于另一支滅過菌裝有9 mL去離子水的試管中，給試管標(biāo)號2，如此反復(fù)8次。從5號、6號、7號、8號試管中分別吸取100 μL菌懸液于已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，涂布（各3組，共12組）。將培養(yǎng)基放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，觀察。待長出菌落后，對菌落標(biāo)號，并在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線法反復(fù)劃線分離，將得到的純種菌株接種到牛肉膏蛋白胨斜面中保存。

1.2.2 ?菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)和生理生化實驗對分離得到的純種菌株進行鑒定，對菌株進行葡萄糖發(fā)酵、芽孢染色、吲哚實驗[17，18]。依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》進行菌株鑒定，通過觀察菌株形態(tài)、生理生化實驗，初步鑒定到屬[16，19]。

1.2.3 ?菌株生長曲線的測定

將各保存好的菌株接種到已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上，振蕩培養(yǎng)20 h，活化菌株;在新鮮已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入1 mL活化好的菌液，在165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上培養(yǎng);以新鮮已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為空白對照，在波長600 nm處用紫外分光光度計測定其吸光值，直到OD值出現(xiàn)下降，停止測定。

1.2.4 ?菌株生長過程中pH值的測定

將活化好的菌株接種在已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)過程中定期測定菌液的pH。

1.2.5 ?菌株接種方式及接種量

將得到的純種菌株分別接種到100 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，各3瓶，在165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上培養(yǎng)，3 d后取出備用。

在無菌操作臺對已滅菌的每瓶150 mL的原油液體培養(yǎng)基標(biāo)號：D1、D2、D3、D4、D5、D1-2、D1-3、D1-4、D1-5、D2-3、D2-4、D2-5、D3-4、D3-5、D4-5、D1-2-3、D1-2-4、D1-2-5、D1-3-4、D1-3-5、D1-4-5、D2-3-4、D2-3-5、D2-4-5、D3-4-5。按照標(biāo)號向原油液體培養(yǎng)基中各接種5 mL在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的菌液（例如標(biāo)號為D1-2的原油液體培養(yǎng)基，分別接種D1菌液和D2菌液各5 mL），同時設(shè)置D0（D0為不接種菌株的空白對照組），置于165 r/min轉(zhuǎn)速、37 ℃的水浴振蕩器上培養(yǎng)7 d（各3組）。

1.2.6 ?原油降解率的測定

單株菌株及組合菌株的原油降解率采用《CJ/T 57-1999》中規(guī)定方法進行測定：在原油降解培養(yǎng)體系中加入25 mL石油醚，超聲萃取其中的石油，共重復(fù)3次，合并上層液于分液漏斗，收集上層液，并向其中加入無水硫酸鈉脫水，輕輕搖動，至不結(jié)塊為止，加蓋放置1 h，用預(yù)先以石油醚洗提過的濾紙過濾，收集濾液于經(jīng)烘干恒重的蒸發(fā)皿中[20]。將蒸發(fā)皿置于65 ℃烘箱中烘干，放于干燥器中冷卻30 min，稱重直至恒重，[21]計算原油降油率，計算公式如下[22]：

2 ?實驗結(jié)果與分析

2.1 ?石油降解菌株的分離純化

在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中長出的菌落，菌落分布較為均勻，見圖1，表明措施廢液集中處理后的殘渣中確實存在微生物。將分離得到的純種菌株制作微生物裝片，在電子顯微鏡下觀察到微生物形如米粒狀，大小、長短不一。

2.2 ?菌株的鑒定

菌株D1產(chǎn)生芽孢、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)陽性，表明菌株D1屬于芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）。菌株D2產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、革蘭氏染色

結(jié)果呈現(xiàn)陽性、顏色灰白，表明菌株D2屬于鏈球菌屬（Streptococcus sp.）。菌株D3產(chǎn)生吲哚、不產(chǎn)氣不產(chǎn)酸、革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)陰性，表明菌株D3屬于黃桿菌屬（Flavobacterium Bergey sp.）。菌株D4不產(chǎn)生芽孢、產(chǎn)氣不產(chǎn)酸、革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)陽性，表明菌株D4屬于微球菌屬（Micrococcus Cohn sp.）。菌株D5不產(chǎn)生吲哚、不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)陽性，表明菌株D5屬于產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes sp.）。5種菌株在光學(xué)顯微鏡下觀察的結(jié)晶紫單染色照片見圖2。

2.3 ?菌株生長曲線

5種菌株各階段發(fā)生時間有所差別，但生長曲線趨勢基本相同。菌株D1的對數(shù)生長期在接種后18～27 h，30 h時開始進入穩(wěn)定期，D2的對數(shù)生長期在接種后9～25 h，26 h時開始進入穩(wěn)定期，D3的對數(shù)生長期在接種后10～25 h，25 h時開始進入穩(wěn)定期，D4的對數(shù)生長期在接種后8～30 h，30 h時隨即開始進入穩(wěn)定期，D5的對數(shù)生長期在接種后10～25 h，30 h時開始進入穩(wěn)定期，見圖3。結(jié)果表明，這5種菌株生長迅速，30 h均能達到最大菌數(shù)，可以在短時間得到大量的原油降解菌液。

2.4 ?菌株生長過程pH值變化曲線

5株菌株在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前4 d，菌液的pH值均成上升趨勢，4 d后pH值變化不大?？瞻椎呐Ｈ飧嗟鞍纂艘后w培養(yǎng)基的pH值呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，下降不到1個pH值，見圖4。

說明5株菌株在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生使得培養(yǎng)液pH值上升的產(chǎn)物，使得培養(yǎng)液為堿性，有利于微生物對原油的降解。

2.5 ?原油降油率

單菌的降油率D1>D4>D2>D5>D3，降油率最高的菌株是D1，降油率為76.83%，見圖5。D1-4組合接種的菌種降油率最高，降油率為89.39%;其次是D1-5組合、D4-5組合，其降油率均大于87%。降油率最低的是D2-3組合，降油率為71.28%，見圖6。三菌組合接種的菌種降油率最高的是D1-2-5組合，降油率為86.10%。其次是D1-4-5組合、D2-4-5組合，其降油率均大于84%。降油率最低的是D2-3-5組合，降油率為67.85%，見圖7。單就原油降解率而言，兩菌組合的降油率優(yōu)于三菌組合優(yōu)于單株菌株，菌株組合后接種降油率的高低取決于組合菌株間的不同作用，有的菌株組合接種后起協(xié)同作用，有的菌株組合接種后起抑制作用。

3 ?結(jié) 論

從長慶油田污水處理站措施廢液集中處理后殘渣中分離篩選出了5株降解石油能力較強的菌株。降解原油效果最差的是D3，降解率為65.15%;降解原油效果最好的是D1，降解率為76.83%。

2株菌株組合中，降解率最低為71.28%，有6個組合降解率超過83.00%，降解原油效果最好的是D1、D4組合，降解率為89.39%。3株菌株組合中，降解率最低為67.85%，有4個組合降解率超過83.00%，降解原油效果最好的D1、D2、D5組合，降解率為86.10%。某些3株菌株組合的原油降解效果較優(yōu)于2株菌株組合。5株菌株均能在30 h內(nèi)達到最大菌數(shù)，且菌株會產(chǎn)生堿性產(chǎn)物，為較短時間內(nèi)去除長慶油田污水處理站措施廢液集中處理后殘渣中的原油，提供了菌株支持，也為其資源化利用提供了條件。

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