高尿素促進心肌細胞發(fā)生脂質代謝紊亂的實驗研究

于蘭英 劉恬恬 付雙 劉晟 舒楠淇 杜艷偉 孟艷

尿素是哺乳動物蛋白質分解代謝的主要終末產(chǎn)物，具有高水溶性及低脂溶性，在肝臟內(nèi)合成并濃縮在哺乳動物的腎臟中。尿素在哺乳動物肝臟內(nèi)合成的過程，被稱為尿素循環(huán)，為哺乳動物生命活動必須環(huán)節(jié)。尿素循環(huán)的主要目的是合成組織細胞活動所需的一氧化氮和多胺等，并在這個過程中催化精氨酸轉變?yōu)轼B氨酸。研究人員在哺乳動物的心臟中也發(fā)現(xiàn)了部分尿素循環(huán)，有實驗表明小鼠心肌細胞內(nèi)尿素的堆積能促使小鼠發(fā)生心肌肥大。本研究擬利用心肌細胞（H9C2）建立高尿素模型，探討高尿素對心肌細胞脂質代謝的影響，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 H9C2 細胞由上海拜力生物科技有限公司提供，DMEM 高糖基礎培養(yǎng)基、胎牛血清由美國Gibco 公司提供，蛋白裂解液由美國Sigma 公司提供，RIPA 緩沖液由美國Boston BioProducts 公司提供，BCA 蛋白質測定試劑盒、ECL 顯色液由美國賽默飛世爾科技提供，心房利鈉尿多肽（atrial natriuretic polypeptide，ANP）一抗、β-actin 抗體、羊抗兔IgG 二抗（北京博奧森公司，產(chǎn)品編號：bs-2040R、bs-0061R、bs-0295G），PVDF 膜（美國Millipore 公司），油紅O 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），總膽固醇（TCH 酶法）測試盒、甘油三酯（TG 酶法）測試盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9C2 細胞用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素以及0.1mg/ml 鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱進行孵育。在本項實驗中，取對數(shù)生長期的H9C2 細胞進行鋪板，使各皿內(nèi)細胞密度相等，24h 后模型組加入20mM 尿素，對照組加入1%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS），繼續(xù)培養(yǎng)。處理后分別于24、48及72h 提取細胞蛋白并用于后續(xù)實驗。

1.2.2 H9C2 細胞ANP 表達水平檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測心肌細胞ANP 表達水平。收取H9C2細胞，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中裂解。通過離心獲得上清液，抽取出的蛋白使用BCA 蛋白質測定試劑盒測定濃度，根據(jù)標準曲線進行蛋白定量。用12%SDS-PAGE 凝膠分離等量的蛋白質樣品，并轉到PVDF 膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1h，并在4℃下與適當濃度的一抗孵育過夜。次日用TBST 洗膜3 次后加入適當濃度稀釋的二抗，室溫下繼續(xù)孵育1h 后將膜用TBST 洗滌3次，加入ECL 顯色液進行顯色，記錄實驗結果，使用圖像分析軟件（Image J）分析條帶的密度。

1.2.3 H9C2 細胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)觀測 通過油紅O 染色方法，觀察心肌細胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)。分別取對照組與24、48、72h 的模型組細胞進行觀察。移除細胞培養(yǎng)基，用PBS 清洗細胞后用60%異丙醇固定，加入油紅染料對細胞內(nèi)脂滴進行染色，后加入Mayer 蘇木素染色液對細胞核進行復染，棄去染色液，加入蒸餾水覆蓋細胞并在倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）下進行觀察，拍照。

1.2.4 H9C2 細胞內(nèi)脂類含量測定 采用德國奧芬堡FLUOstar Omega 酶標儀檢測細胞內(nèi)脂類含量。分別取對照組與24、48、72h 的模型組細胞進行觀察。采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中進行細胞裂解，冰水浴條件下超聲破碎，制備好的勻漿液不離心，直接吸取加入96 孔板，總膽固醇、甘油三酯于510nm 波長測定，HDL-C、LDL-C 于570nm 波長測定。所剩勻漿進行BCA 蛋白定量。最終結合測定結果與BCA 定量結果計算細胞內(nèi)各脂類含量。所得數(shù)據(jù)使用GraphPad 進行處理，并繪制柱形圖。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，各組內(nèi)均數(shù)比較采用post hoc 分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 H9C2 細胞ANP 表達水平比較 見圖1。

圖1 H9C2 細胞ANP 表達水平比較（注：*P＜0.05）

由圖1 可見，與對照組比較，模型組心肌細胞ANP 表達水平顯著增高，且隨時間呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2 H9C2 細胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài) 見圖2。

由圖2 可見，與對照組比較，24h 模型組心肌細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。

2.3 H9C2 細胞內(nèi)脂類含量變化 見圖3。

由圖3 可見，與對照組比較，模型組心肌細胞總膽固醇、甘油三酯，HDL-C、LDL-C 含量均明顯增高，組內(nèi)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖2 H9C2 細胞內(nèi)脂滴堆積狀態(tài)（A：對照組；B：24h 模型組；油紅O染色，×400）

圖3 H9C2 細胞內(nèi)各類脂質含量

3 討論

心肌肥大作為心臟的一種強而有力的代償形式，是心臟疾病進展的主要預后因子之一，臨床上常常將其與高血壓、心力衰竭以及缺血性心臟病等多種心臟疾病相聯(lián)系，長期心肌肥大增加了心臟衰竭和猝死的危險性[1-4]。到目前為止，人們主要將神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度活化作為心肌肥大和心力衰竭預防與治療的靶點，臨床上血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）、β 受體阻滯劑以及醛固酮拮抗劑也被廣泛應用到疾病治療的過程中，這些治療手段無疑減緩了患者的痛苦及臨床表現(xiàn)，延緩了心肌疾病的進程，但無法阻止其惡化的過程[5-6]。因此進一步探討研究心臟疾病的機制，以制定相應的干預措施，仍然是研究人員的主要任務之一。

心臟是一個高耗能器官，通過對各種外源性底物的應用產(chǎn)生能量，這個過程受到底物濃度、氧的供應和心血管系統(tǒng)激素水平的影響，而在心臟面對各種刺激的情況下，心臟能彈性選擇用于供能的底物[9]，從而保持能量功能與心臟功能的平衡。常氧條件下，心臟中的ATP 主要來自于線粒體的氧化磷酸化和糖酵解，以及對脂肪酸和葡萄糖的利用。當心肌喪失“自主”彈性選擇底物的能力，對于某種特殊底物的過分依賴，會導致線粒體功能障礙，引起心肌細胞的一系列病理性變化，加速細胞生長凋亡，最后致使心肌收縮舒張功能下降。在2004 年，Van Bilsen 提出心肌代謝重構的概念，指出心臟在慢性超負荷以及底物供應改變時，出現(xiàn)線粒體功能失調以及高能磷酸鹽代謝異常的現(xiàn)象[7-8]。隨后又有實驗證明，在心肌肥大早期及心力衰竭的失代償期存在能量代謝障礙，在這個過程中最具特征的便是線粒體功能障礙。

尿素通道蛋白是尿素跨膜轉運的蛋白，前期實驗研究證明，尿素通道蛋白缺失導致小鼠心肌細胞尿素堆積。此外，尿素轉運蛋白基因敲除小鼠心肌活性氧產(chǎn)量增高，氧化應激水平增加[9]。針對這些現(xiàn)象，本實驗選擇利用心肌細胞（H9C2 細胞）以及20mM尿素建立高尿素模型，探討高尿素對心肌細胞脂質代謝的影響。研究結果表明，在高尿素負荷下，心肌重構標志蛋白ANP 表達水平增高，心肌細胞內(nèi)發(fā)生明顯的脂肪堆積，與脂肪生成和運送相關的脂類物質含量也出現(xiàn)增加，并且這些現(xiàn)象隨時間呈遞增趨勢。這既是對之前一些研究的進一步證實，也是為之后的研究提出了思路與建議。

本次研究的實驗結果暗示了高尿素可使得心肌細胞內(nèi)脂質代謝異常，可促進心肌細胞發(fā)生脂質代謝紊亂，然而其具體機制仍待進一步研究證實。我們有理由相信基于此方向的心肌疾病機制研究將為臨床治療心臟疾病提供新的靶點與策略，同時也為臨床開發(fā)新的不良反應更小的治療藥物提供了思路。