雙氫青蒿素和吉非替尼聯(lián)用對(duì)肺癌NCI-H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax與Bcl-2表達(dá)的影響

金紅 楊嵐 張黎 莫迪 李夢雨 武艷 季洪良 姜愛英

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157011；2眼科;3科研科;牡丹江醫(yī)學(xué)院 4第一臨床醫(yī)學(xué)院;5醫(yī)藥研究中心；6牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院呼吸科)

目前肺癌已成為我國位居第一的癌癥殺手，也是男性居首位的癌癥死亡原因，女性第二位的癌癥死亡原因〔1，2〕。吉非替尼作為非小細(xì)胞肺癌治療的一線藥物，被廣泛應(yīng)用于臨床，但由于耐藥導(dǎo)致治療受限，因此開發(fā)多靶點(diǎn)的靶向治療藥物來增強(qiáng)吉非替尼作用敏感性是目前研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素(DHA)具有抗腫瘤活性〔2〕，本研究旨在探討DHA和吉非替尼聯(lián)用對(duì)肺癌NCI-H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax與Bcl-2表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1一般材料 人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞株購自中科院，10%胎牛血清和CCK8檢測試劑盒購自中國海門碧云天生物技術(shù)研究所，Bcl-2 抗體、Bax抗體購自美國Abcam，吉非替尼和DHA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2藥物處理 DHA以二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為1×10-1mol/L儲(chǔ)存液(DMSO濃度≤1‰)，-20℃避光保存。吉非替尼10 mg，置100 ml量瓶中，用DMSO溶解并稀釋濃度為100 μg/ml，-4℃保存。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組、吉非替尼組、DHA組、DHA+吉非替尼聯(lián)合用藥(聯(lián)合)組。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與接種 NCI-H1975細(xì)胞復(fù)蘇后，待細(xì)胞生長到一定數(shù)量后，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)以后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，按每孔0.1 ml接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5用CCK8法檢測細(xì)胞增殖 取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以密度為5×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，然后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長并達(dá)80%時(shí)，完全培養(yǎng)基稀釋吉非替尼和DHA分別至5個(gè)不同濃度，交叉組合作用24 h，向每孔加入20 μl CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～4 h，在420 nm波長下用酶標(biāo)儀測定每個(gè)樣本的吸光度(OD)值，每個(gè)樣品重復(fù)做3次。細(xì)胞存活率=OD用藥組/OD對(duì)照組×100%。對(duì)DHA與吉非替尼單獨(dú)和聯(lián)合給藥的原始數(shù)據(jù)按照聯(lián)合指數(shù)(CI)法進(jìn)行分析，采用CalcuSyn軟件計(jì)算聯(lián)合用藥的CI。

1.6TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞用4%多聚甲醛在室溫下固定30～60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含0.1% Triton X-100的枸櫞酸鈉緩沖液浸透，冰浴孵育2 min，PBS洗滌2次，加入50 μl原位凋亡檢測試劑盒的TUNEL檢測液，細(xì)胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，于37℃下避光孵育60 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光波長450～500 nm，發(fā)射波長515～565 nm(綠色熒光)，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))。

1.7流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 NCI-H1975細(xì)胞被接種于6孔板上，用DHA和(或)吉非替尼藥物作用于細(xì)胞，37℃孵育24 h。細(xì)胞用PBS洗滌2～3次后，用70%乙醇固定后在4℃過夜，最后，細(xì)胞在室溫下用80 mg/ml胰核糖核酸酶處理，轉(zhuǎn)移至試管中，加入50 mg/ml碘化丙啶(PI)染色液，室溫避光染色30 min，加入緩沖液，將全部液體轉(zhuǎn)移至流式管中，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量。測定DNA含量后，可用流式細(xì)胞儀配備的分析軟件Coulter?Epics?XLTMFlow Cytometer對(duì)其進(jìn)行自動(dòng)分析，測定的細(xì)胞周期按照DNA量分為G0/G1期、S期及G2/M期，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相所占比例。

1.8蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將藥物處理后的細(xì)胞收集加入裂解液，各組提取的總蛋白樣品30～90 μg在10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉)，浸泡被轉(zhuǎn)印膜，室溫反應(yīng)1 h，封閉轉(zhuǎn)印膜上的一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，防止發(fā)生非特異性反應(yīng)；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡；然后用第一抗體在4℃孵育過夜(抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體抗β-actin抗體)，棄一抗，用0.01 mol/L包含0.5% Tween 20的PBS分別洗膜，10 min×3次，振蕩；加入熒光標(biāo)記的二抗溶液，室溫下反應(yīng)1 h，保持平緩搖動(dòng)；棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜，10 min×4次，振蕩。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色：將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色3 min，將膜用濾紙吸干，以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、χ2及Fisher檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1DHA和吉非替尼對(duì)NCI-H1975細(xì)胞聯(lián)合用藥的藥物濃度確定 0、5、10、20、50、100 μmol/L DHA作用于NCI-H1975細(xì)胞OD值分別為：2.81±0.54、2.54±0.36、2.34±0.41、1.87±0.21、0.89±0.04、0.32±0.02；0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L吉非替尼作用于NCI-H1975細(xì)胞OD值分別為：3.01±0.51、2.89±0.42、2.49±0.28、2.02±0.14、1.54±0.08、0.31±0.05。DHA和吉非替尼單獨(dú)用藥均對(duì)人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系DHA(10 μmol/L)+吉非替尼(10 μmol/L)組OD值 (1.18±0.21)顯著低于對(duì)照組(2.81±0.78)、吉非替尼組(2.01±0.45)及DHA(5 μmol/L)+吉非替尼(5 μmol/L)組(1.98±0.51)。DHA(10 μmol/L)與吉非替尼(10 μmol/L)聯(lián)合應(yīng)用于NCI-H1975細(xì)胞的CI值為0.64，說明二者聯(lián)合為協(xié)同效應(yīng)。因此，采用10 μmol/L DHA作為聯(lián)合吉非替尼的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物濃度。見表1。

2.2DHA與吉非替尼聯(lián)合用藥對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖的抑制作用 與對(duì)照組(2.81±0.78)比較，吉非替尼組(1.98±0.51)對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；聯(lián)合用藥組(1.18±0.21)能增強(qiáng)對(duì)NCI-H1975細(xì)胞的抑制作用，且與吉非替尼組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3各組NCI-H1975細(xì)胞凋亡比較 對(duì)照組細(xì)胞核呈圓形，DAPI染色均勻，而吉非替尼組和聯(lián)合組細(xì)胞核不規(guī)則，染色不均勻及片段化。DHA組細(xì)胞凋亡率為(2.98±0.09)%。與對(duì)照組〔(2.15±0.12)%〕比較，吉非替尼組〔(20.15±3.21)%〕能明顯增加NCI-H1975細(xì)胞凋亡率(P<0.01)；與吉非替尼組相比，聯(lián)合組〔(35.41±5.23)%〕能明顯增加NCI-H1975細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。見圖1。

表1 DHA與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NCI-H1975細(xì)胞作用的CI值

圖1 各組NCI-H1975細(xì)胞凋亡結(jié)果(×100)

2.4各組NCI-H1975細(xì)胞周期分布比較 吉非替尼組和聯(lián)合組G0/G1期、G2/M期細(xì)胞所占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組S期細(xì)胞所占比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見圖2，表2。

圖2 DHA與吉非替尼對(duì)NCI-H1975細(xì)胞周期分布的影響

表2 各組NCI-H1975細(xì)胞周期分布比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與吉非替尼組比較：2)P<0.05；表3同

2.5DHA和吉非替尼對(duì)NCI-H1975細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax和Bcl-2)表達(dá)水平的影響 與吉非替尼單獨(dú)用藥組比較，聯(lián)合用藥組中Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Bax/Bcl-2的比值明顯升高，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖3、表3。

1～4：對(duì)照組、DHA組、吉非替尼組、聯(lián)合組圖3 各組Bax 和 Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

表3 各組凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌是引起癌癥死亡的主要原因之一〔3〕。臨床上通過化療藥物之間的聯(lián)合作用來提高單藥作用的敏感性已成為治療癌癥的新策略，也將成為未來治療癌癥的發(fā)展趨勢。目前將吉非替尼與放療聯(lián)合或與其他化療藥物聯(lián)合治療肺癌，以期提高吉非替尼藥物的療效，尋求克服吉非替尼的耐藥性的研究還較少。DHA是青蒿素成分中有效的代謝物，是一種被廣泛用于抗瘧疾的治療藥劑〔4～6〕，已有研究發(fā)現(xiàn)DHA在多種腫瘤細(xì)胞中均具有抗癌作用，能減少腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔7～9〕，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞具有較低毒性而成為一種新型的抗腫瘤藥物。有研究報(bào)道其他化療藥物與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)吉非替尼的敏感性，使藥效增強(qiáng)〔10，11〕。薛斌〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的DHA能夠?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，促進(jìn)凋亡的作用與Bcl-2和survivin下調(diào)有關(guān)，最終通過含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)-9和caspase-3的活化而實(shí)現(xiàn)。

在惡性腫瘤發(fā)展過程中，不僅是細(xì)胞增殖失控和分化異常的結(jié)果，且與凋亡的抑制密切相關(guān)。存在于惡性腫瘤中的自發(fā)凋亡可能是引起腫瘤消退的一種自身治療腫瘤的作用。細(xì)胞凋亡可以被腫瘤的放療、化療和生物治療等各種刺激所誘導(dǎo)，是機(jī)體對(duì)各種刺激起到的一種自身保護(hù)和調(diào)節(jié)作用。腫瘤是細(xì)胞增殖和死亡異常引起的疾病，細(xì)胞凋亡對(duì)維持正常生理功能起到重要作用，隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡過程受基因調(diào)控，Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡中起重要作用的一類蛋白質(zhì)〔12〕。Bcl-2 蛋白是Bcl-2家族中最具有代表性的抑制凋亡基因，通過抑制蛋白酶的激活所需的適配器促進(jìn)細(xì)胞生存，Bcl-2的升高可以提高各種類型的細(xì)胞生存和促進(jìn)癌癥進(jìn)展，且Bax蛋白對(duì)Bcl-2蛋白活性具有調(diào)控作用，是Bcl-2家族中最具代表性的促進(jìn)凋亡的基因，腫瘤的放療、化療及生物治療作用主要通過Bax和Bcl-2對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用〔13〕，二者形成了細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控，二者比例決定了細(xì)胞是否凋亡，比例增高抑制細(xì)胞凋亡，比例降低則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，相較于吉非替尼單獨(dú)用藥，DHA與吉非替尼聯(lián)合用藥能增強(qiáng)誘導(dǎo)NCI-H1975細(xì)胞凋亡作用；能更明顯地上調(diào)NCI-H1975細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)水平，使NCI-H1975細(xì)胞Bax/Bcl-2比值升高。

本研究首次研究DHA增強(qiáng)人肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，但其中的作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜、多因素、多層次、多條信號(hào)通路共同參與的相互作用的抗癌過程，其研究仍處于基礎(chǔ)階段。