LanCL1過表達對氧糖剝奪誘導(dǎo)PC12細胞凋亡及Sirt3-PGC-1α通路的影響

王御林 高元杰 鐘純正 王生成 王曉峰

(儋州市人民醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571700；2呼吸內(nèi)科)

缺氧缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的50%以上，腦部缺血缺氧易造成神經(jīng)功能損傷引發(fā)腦卒中，是導(dǎo)致患者死亡和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一〔1〕。目前缺血性腦損傷的病理機制尚不完全清除，已證實神經(jīng)細胞凋亡是缺血性腦損傷的主要表現(xiàn)形式，對腦損傷范圍及患者神經(jīng)功能預(yù)后起決定性作用〔2,3〕。因此，研究神經(jīng)細胞凋亡機制對臨床治療腦缺血性疾病具有重要意義。研究表明，人源硫化雙丙氨酸環(huán)化酶樣蛋白(LanCL)1在腦神經(jīng)元中表達，受神經(jīng)元活動誘導(dǎo)，是響應(yīng)氧化應(yīng)激并減輕神經(jīng)元損傷所必需的元素，對神經(jīng)細胞具有保護作用〔4〕。本研究以神經(jīng)細胞株P(guān)C12細胞為研究對象，模擬氧糖剝奪(OGD)模式，分析OGD條件下PC12細胞中LanCL1的表達變化，探討過表達LanCL1對PC12凋亡的影響及其保護神經(jīng)細胞的可能作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料 PC12未分化細胞購于豐暉生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和青霉素、鏈霉素購于美國Hyclone公司，磷脂結(jié)合蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物，pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-LanCL1合成于武漢伯遠生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購于美國Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，沉默調(diào)節(jié)蛋白(Sirt)3抗體一抗、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)-1α抗體一抗、LanCL1抗體、辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗購于武漢艾美捷科技有限公司。FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)，VeritiTMPCR儀(美國Thermo Scientific公司)，7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(德國Binder公司)，Multiskan Sky全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2細胞培養(yǎng) 將PC12細胞置于含有5%胎牛血清、10%馬血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后進行傳代，取細胞密度5×105個/ml接種，每2～3 d換液一次，待細胞密度至(2～4)×106個/ml時進行第2次傳代。使用神經(jīng)生長因子(NGF)50 ng/ml處理第2代對數(shù)生長期細胞，促進細胞分化。

1.3細胞分組 將細胞分為4組，對照組為正常培養(yǎng)的PC12細胞；OGD組將PC12細胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；pcDNA3.1組為將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染至PC12細胞(轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明書進行)，并將細胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；pcLanCL1組為將pcDNA3.1-LanCL1轉(zhuǎn)染至PC12細胞，并將細胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4RT-PCR檢測LanCL1 mRNA表達 采用Trizol試劑分別提取對照組和OGD組培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h細胞總RNA，使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，稀釋cDNA為統(tǒng)一濃度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，RT-PCR檢測LanCL1 mRNA相對表達量，RT-PCR體系參照定量RT-PCR試劑盒，模板量為1 μl，程序：95℃ 2 min；95℃ 1 min；55℃ 2 min，共40個循環(huán)。LanCL1引物序列：正向5′-CCTTCAGGTGAACCAAGGAA-3′，反向5′-AGATCACGTCAGCACACTGC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，反向5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。同時檢測pcDNA3.1組和pcLanCL1組細胞培養(yǎng)24 h時LanCL1 mRNA相對表達量，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.5MTT實驗檢測細胞生存率 收集各組細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，按每組的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光培養(yǎng)4 h。倒掉培養(yǎng)基，每孔加入200 μl DMSO，震蕩混勻1 min，在酶標儀上測定570 nm處吸光度。

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，離心棄PBS后，加入PBS重懸細胞，過濾，棄PBS。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Annexin V和PI染色液，避光染色30 min，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

1.7Western印跡檢測LanCL1、Sirt3和PGC-1α蛋白表達 收集1.3中各組培養(yǎng)6、12、24、48 h后的細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的條帶后，轉(zhuǎn)至纖維素膜(轉(zhuǎn)膜過程中帶上干凈的無菌手套，避免污染及損壞薄膜)，封閉2 h后，分別加入稀釋過的LanCL1抗體、Sirt3抗體和PGC-1α抗體一抗，4℃過夜孵育，然后加入稀釋的辣根過氧化物標記的羊抗兔二抗，繼續(xù)孵育2 h，抗體稀釋比例參照說明書。加入顯色劑顯色后，放入Kodak數(shù)字成像系統(tǒng)進行掃描，并采用Image J軟件分析目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行χ2檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LanCL1在OGD PC12細胞中表達降低 與對照組PC12細胞相比，OGD組PC12細胞中LanCL1 mRNA和蛋白表達量均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組各時間點PC12細胞中LanCL1 mRNA及蛋白的表達水平

與對照組比較，1)P<0.05

圖1 兩組PC12細胞中LanCL1蛋白表達

2.2LanCL1過表達促進OGD PC12細胞存活 對照組、OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組LanCL1 mRNA相對表達量分別是1.86±0.41、0.79±0.24、0.70±0.17、1.81±0.39，pcLanCL1組細胞中LanCL1 mRNA相對表達量顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，說明細胞轉(zhuǎn)染實驗成功。OGD組和pcDNA3.1組細胞存活率〔(45.38±9.42)%、(44.46±10.83)%〕顯著低于對照組〔(95.67±17.23)%，P<0.05〕；pcLanCL1組細胞存活率〔(88.94±15.27)%〕較OGD組和pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明過表達LanCL1促進OGD條件下PC12細胞生存。

2.3LanCL1過表達抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡 OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組細胞凋亡率〔(46.83±10.74)%、(45.33±9.86)%、(21.19±3.68)%〕均顯著高于對照組〔(13.37±2.51)%,P<0.05〕，pcDNA3.1組細胞凋亡率與OGD組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，pcLanCL1組細胞凋亡率顯著低于OGD組(P<0.05)，說明LanCL1過表達抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

2.4LanCL1過表達促進OGD PC12細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達 OGD組和pcDNA3.1組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均顯著低于對照組(P<0.05)；pcLanCL1組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達量均顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明LanCL1過表達能夠促進OGD PC12細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達。見圖3，表2。

1～4：對照組、OGD組、pcDNA3.1組、pcLanCL1組圖3 各組細胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達水平

組別Sirt3PGC-1α對照組1.24±0.391.19±0.28OGD組0.62±0.251)2)0.61±0.231)2)pcDNA3.1組0.61±0.221)2)0.59±0.181)2)pcLanCL1組1.08±0.351.03±0.32

與對照組比較：1)P<0.05；與pcLanCL1組比較，2)P<0.05

3 討 論

近年來，雖然腦缺血缺氧引起的腦卒中死亡率有所下降，但腦卒中仍是全球人類死亡和殘疾的主要原因〔5〕。目前，組織型纖溶酶原激活劑是唯一獲得食品藥品監(jiān)督管理局批準的用于治療急性缺血性腦卒中的治療藥物，因此神經(jīng)保護藥物的研發(fā)和應(yīng)用對腦卒中患者具有重要意義。LanCL1是LanC樣蛋白家族成員，以往研究證實LanCL1能特異性結(jié)合還原型谷胱甘肽(GSH)，參與氧化還原調(diào)節(jié)〔6〕。近年來動物模型實驗表明，LanCL1蛋白在腦、脊髓中高表達，表現(xiàn)出受神經(jīng)元活動調(diào)節(jié)，并且在神經(jīng)元抗氧化活性中起關(guān)鍵作用〔7〕。本研究說明LanCL1在神經(jīng)細胞損傷保護中起作用。此外，本研究還通過檢測Sirt3-PGC-1α通路闡述了LanCL1保護神經(jīng)細胞的可能潛在機制。

Sirt3是NAD+依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，主要定位在線粒體，是線粒體功能調(diào)節(jié)因子，在抗細胞凋亡和抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用〔8,9〕。研究報道，Sirt3在衰老、神經(jīng)退行性疾病和抗逆性中可以預(yù)防神經(jīng)紊亂，起到神經(jīng)保護作用，且Sirt3的激活可以介導(dǎo)各種保護劑對腦卒中的有益作用〔10,11〕。本研究與Xie等〔12〕研究結(jié)果相似。Sirt3抑制細胞凋亡的作用主要有：①可直接調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔關(guān)閉，抑制促凋亡蛋白釋放而降低細胞凋亡率〔13〕；②Sirt3也可通過清除氧自由基抑制氧化應(yīng)激引起的細胞凋亡〔14〕；③通過抑制c-Jun氨基末端激酶的磷酸化或通過去乙?；疨53激活抗凋亡途徑而抑制細胞凋亡〔15〕。提示過表達LanCL1可能通過誘導(dǎo)Sirt3表達升高降低OGD誘導(dǎo)的PC12細胞死亡。

PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，在調(diào)節(jié)大腦等線粒體生物合成和能量代謝中起關(guān)鍵作用〔16,17〕。Wang等〔18〕研究表明，敲除Sirt3加劇OGD誘導(dǎo)的PC12細胞損傷，而過表達Sirt3可以保護OGD誘導(dǎo)的PC12細胞死亡，其保護作用依賴于PGC-1α和錳超氧化物歧化酶。研究報道，PGC-1α-Sirt3途徑可通過直接去乙?；腿姿嵯佘?ATP)中的ATP合酶β來預(yù)防神經(jīng)元細胞凋亡〔19,20〕。本研究提示LanCL1對保護OGD誘導(dǎo)的PC12細胞的保護作用可能與PGC-1α-Sirt3途徑密切相關(guān)，過表達LanCL1能夠通過Sirt3-PGC-1α信號途徑保護OGD誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡。

本研究初步分析LanCL1在OGD條件下PC12細胞中的表達作用及其可能作用機制，后期將會繼續(xù)驗證其神經(jīng)元保護作用，為臨床治療腦缺血缺氧性疾病提供理論參考和新的治療靶點。