智三針電針改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能及機(jī)制

朱世 唐中生 胡雪梅 魏宇唯 林吉

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院)

血管性癡呆(VD)是老年人常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型之一，嚴(yán)重?fù)p害中老年人的健康，在早期階段有效防治VD具有重大的社會(huì)意義〔1〕。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Eph受體及其配體ephrin在突觸特異性連接的建立過(guò)程及可塑性的調(diào)節(jié)等方面都有重要作用〔2〕，進(jìn)而影響到大腦的學(xué)習(xí)與記憶功能〔3〕。智三針電針療法對(duì)VD有積極的預(yù)防和治療作用。本文通過(guò)研究Eph/ephrin對(duì)突觸棘形態(tài)結(jié)構(gòu)可塑性的調(diào)控，探討智三針電針對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶改善的主要機(jī)制，為臨床電針治療VD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重300～320 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0011。

1.2器材 手術(shù)器械1套，華佗牌針灸針(0.3 mm×40 mm，蘇州醫(yī)療用品廠)。石蠟組織包埋機(jī)(德國(guó)Lica公司，EG1140)；石蠟組織切片機(jī)(德國(guó)Lica公司，RM2145)；BX51型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；高速冷凍離心機(jī)(湘儀貝克)；Morris水迷宮(江蘇賽昂斯公司)；微型動(dòng)脈夾、加熱式單極電凝針(杭州康生醫(yī)療)等。

1.3藥品與試劑 戊巴比妥鈉(P3761，Sigma)；尼莫地平片(亞寶藥業(yè)公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14022821)；4%多聚甲醛，蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒(賽默飛，貨號(hào)23246)、一步法快速Western印跡試劑盒(兔、鼠)、ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒、β-actin抗鼠單克隆抗體(北京康為世紀(jì))；ephrinB3、EphA4、ephrinA3、EphB2(博奧森)，干擾素(IFN)-γ、C1q試劑盒(Elabscience)。組織包埋盒(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材公司，31050102W)。

1.4分組 將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD 模型組、尼莫地平組和電針組，剔除造模過(guò)程中死亡的大鼠，保證每組12 只。

1.5動(dòng)物模型的建立 采用改良四血管阻斷法(4-VO)模擬大鼠VD模型〔4，5〕。采用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔麻醉，電凝針灼燒凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈，動(dòng)脈夾反復(fù)夾閉頸總動(dòng)脈〔5，6〕。將造模成功的大鼠按照前期課題組的設(shè)計(jì)隨機(jī)分為VD 模型組、電針組和尼莫地平組。設(shè)置假手術(shù)組作為陰性對(duì)照，排除手術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，該組不進(jìn)行血管的灼閉和夾閉。術(shù)后各組腹腔注射青霉素預(yù)防感染。

1.6治療方法 術(shù)后7 d，待傷口完全愈合、飲食正常，給予相應(yīng)治療。電針及尼莫地平組每天治療1 次，7 d為1個(gè)療程，共治療3個(gè)療程，療程之間休息1 d。電針組，術(shù)后第7天開(kāi)始治療。采用特制的固定器固定大鼠頭部及四肢，保持其清醒狀態(tài)下，定位大鼠的本神穴及神庭穴〔6〕，施以60 Hz的連續(xù)波，電針治療20 min。尼莫地平組，根據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”確定大鼠灌胃藥量，按12 mg/(kg·d)的用量、3 mg/ml的濃度配制，進(jìn)行灌胃治療。

1.7Morris水迷宮檢測(cè)行為認(rèn)知功能 治療結(jié)束后開(kāi)始水迷宮測(cè)試。第1～6天進(jìn)行路線學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，以迷宮四周的標(biāo)志為參照物，引導(dǎo)大鼠記憶入水點(diǎn)到平臺(tái)的路線，如在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，引導(dǎo)大鼠站在平臺(tái)上記憶參照物及路線，記錄找到平臺(tái)所用時(shí)間，如未在規(guī)定時(shí)間內(nèi)找到平臺(tái)，時(shí)間記為120 s。第7天進(jìn)行路線記憶實(shí)驗(yàn)：記錄2 min內(nèi)大鼠在平臺(tái)所在象限搜索平臺(tái)所用的時(shí)間百分比。

1.8腦組織HE染色〔7〕采用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，先后灌注生理鹽水和多聚甲醛〔5〕，灌注結(jié)束后置于4%多聚甲醛中固定。取大鼠海馬CA1區(qū)，HE染色，光鏡下觀察腦組織細(xì)胞變化。

1.9血漿炎癥因子測(cè)定 用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心20 min取上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IFN-γ、C1q含量。

1.10Western印跡檢測(cè) 稱取大鼠海馬腦組織，盡可能剪碎，先將蛋白抽提試劑進(jìn)行預(yù)冷，加入蛋白酶抑制劑、組織蛋白抽提試劑，冰浴勻漿及超聲破碎；離心收集上清；30%Acr-Bis分離膠緩沖液，10%APS TEMED混勻，制備10%分離膠，上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，20 mA恒流電泳，待預(yù)染Marker條帶分離清晰、間距適宜時(shí)，停止電泳。200 mA恒流，低溫轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，使用一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀(jì)鼠CW2030，兔CW2029)，加入封閉液中，20 min；另取二抗HRP至4 ml離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。在反應(yīng)盒內(nèi)加入高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒A液及B液各1 ml，混勻，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，掃面膠片，定量分析。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組空間學(xué)習(xí)能力比較 隨著訓(xùn)練引導(dǎo)天數(shù)增加，VD模型組尋找平臺(tái)所用時(shí)間比假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，證明VD模型組的學(xué)習(xí)能力低于假手術(shù)組，造模有效。電針組和尼莫地平組尋找平臺(tái)所用時(shí)間比VD模型組明顯縮短(P<0.05)，證明智三針電針和尼莫地平都能提高血VD大鼠學(xué)習(xí)能力。電針組與尼莫地平組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

2.2各組空間記憶能力比較 第7天，VD模型組平臺(tái)象限搜索的時(shí)間百分比明顯低于假手術(shù)組，說(shuō)明VD組記憶能力下降；電針組和尼莫地平組搜索平臺(tái)象限概率顯著高于模型組，說(shuō)明電針治療和尼莫地平都能提高VD大鼠的空間記憶能力，但電針組與尼莫地平組比較搜索時(shí)間百分比及搜索次數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)觀察 HE染色后，低倍鏡下假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整密無(wú)缺失；VD模型組神經(jīng)細(xì)胞各層界限不十分清晰，細(xì)胞出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。高倍鏡下，假手術(shù)組星形細(xì)胞和錐體細(xì)胞形態(tài)較為清楚，細(xì)胞帶排列基本致密完整；VD模型組細(xì)胞排列無(wú)序雜亂，核固縮深染，多數(shù)細(xì)胞溶解壞死，未見(jiàn)細(xì)胞帶；電針組和尼莫地平組較VD模型組變性壞死細(xì)胞明顯減少。提示與假手術(shù)組相比，VD模型組海馬區(qū)病變損傷程度最嚴(yán)重，而電針組病變損傷程度明顯減輕，說(shuō)明電針智三針處理對(duì)VD大鼠海馬區(qū)缺血性損傷有較好的改善作用，尼莫地平組與電針組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

2.4針刺能改善VD大鼠大腦炎癥反應(yīng) VD組血清IFN-γ和C1q含量均明顯高于假手術(shù)組，電針組血清IFN-γ和C1q含量明顯小于VD模型組。提示造模后的大鼠腦缺血會(huì)產(chǎn)生全身性的炎癥反應(yīng)，而智三針電針治療可以減輕VD大鼠腦缺血后的炎癥反應(yīng)。電針組與尼莫地平組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)病理改變(HE)

表1 各組血清IFN-γ和C1q含量比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與VD模型組比較：2)P<0.05；與尼莫地平組比較：3)P<0.05；下表同

2.5Eph/ephrin信號(hào)通路調(diào)控突觸可塑性 與假手術(shù)組比較，VD模型組海馬區(qū)突觸膜表面EphB2和ephrinB3的表達(dá)明顯提高(P<0.05)；與VD模型組比較，電針組海馬區(qū)突觸膜表面EphB2和ephrinB3的表達(dá)明顯提高(P<0.05)。尼莫地平組與電針組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 各組腦組織海馬區(qū)EphB2、ephrinB3表達(dá)

組別EphB2ephrinB3假手術(shù)組0.147±0.0180.212±0.021VD模型組0.052±0.0191)0.120±0.0211)尼莫地平組0.352±0.0231)2)0.377±0.0311)2)電針組0.383±0.0031)2)3)0.358±0.1061)2)3)

3 討 論

腦血管疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，尤其是缺血性腦血管病發(fā)病率逐年增高。VD是目前癡呆和腦缺血領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)?！爸侨槨睘椤敖槨敝唬俏覈?guó)針灸大師靳瑞獨(dú)創(chuàng)的治療老年性癡呆、VD、健忘等有關(guān)智力與記憶方面疾病的經(jīng)典組穴，在臨床上取得了良好的治療效果〔8〕。智三針?biāo)∪?，為神庭穴與兩側(cè)的本神穴。本實(shí)驗(yàn)采用的4-VO模擬的VD大鼠模型，實(shí)際上是大腦的缺血再灌注模型〔9〕。大鼠大腦缺血再灌注的過(guò)程導(dǎo)致了海馬區(qū)神經(jīng)元壞死和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力低下。同時(shí)缺血再灌注過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥因子和補(bǔ)體人血〔10〕。血中的炎癥因子和補(bǔ)體相關(guān)因子會(huì)加重缺血后的腦組織損傷〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)炎癥反應(yīng)參與了腦缺血繼發(fā)性損傷的過(guò)程。證明智三針電針治療減輕了腦缺血后的炎癥反應(yīng)和再灌注對(duì)腦組織的損傷。

突觸前膜的EphB2和突觸后膜的ephrin B3之間的相互作用抑制了MAPK信號(hào)，使效應(yīng)蛋白的生物學(xué)效應(yīng)降低，從而影響突觸功能的可塑性〔12，13〕?；罨腅phB2能夠黏著斑激酶(FAK)與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白R(shí)ho A活化，進(jìn)而調(diào)控樹(shù)突棘形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性〔14，15〕。本研究提示智三針電針和尼莫地平均能調(diào)節(jié)突觸功能的可塑性，提高樹(shù)突棘的形成和促進(jìn)突觸功能的成熟，有利于改善VD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。造模后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，伴隨大腦缺血缺氧及海馬區(qū)大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；智三針電針改善了大腦缺血、海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，提高了大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)突觸前膜EphB2和突觸后膜ephrinB3表達(dá)，降低血清IFN-γ和補(bǔ)體Gq表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。