化肥與綠肥配施對(duì)土壤微生物多樣性的影響

閆庚戌　范丙全

摘要：通過(guò)對(duì)化肥與油菜綠肥配施的幾種不同方式所引起的微生物區(qū)系變化進(jìn)行研究，為探索化肥與綠肥的最佳配施方案，建立保護(hù)土壤的農(nóng)田管理規(guī)程提供理論依據(jù)。土壤樣品取自進(jìn)行了6a化肥綠肥配合的定位試驗(yàn)田，共進(jìn)行5個(gè)施肥方案，利用Biolog技術(shù)，對(duì)施肥后土壤的微生物數(shù)量、微生物碳、無(wú)機(jī)碳、麥角固醇進(jìn)行測(cè)定分析，從而得出土壤中不同菌群數(shù)量及活性的結(jié)論。發(fā)現(xiàn)：低量化肥與綠肥配施有利于增加土壤有機(jī)碳、微生物碳、麥角固醇以及微生物的數(shù)量;不施肥能夠提高土壤革蘭氏陰性（GN）細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性（GP）細(xì)菌的多樣性，有機(jī)和無(wú)機(jī)肥料都能引起土壤GN、GP細(xì)菌多樣性的下降，合理的化肥與綠肥配施，能夠減緩?fù)寥繥N細(xì)菌多樣性下降速度，油菜用作綠肥不利于GP細(xì)菌多樣性的培育;不施肥有利于土壤SFN真菌多樣性的保持，施肥會(huì)使土壤SFN真菌多樣性下降，單施化肥會(huì)導(dǎo)致SFP真菌多樣性的下降，綠肥和中量化肥配施能夠提高SFP真菌的多樣性。

關(guān)鍵詞：土壤;施肥;微生物多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191115001

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：30270048）;國(guó)家863項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號(hào)：2003AA241150）;所長(zhǎng)基金課題“農(nóng)業(yè)微生物學(xué)的宏觀(guān)研究”（項(xiàng)目編號(hào)：2002）

*為本文通訊作者

目前，我國(guó)每年的化肥施用量在6000萬(wàn)t左右，中國(guó)能以占世界7%的耕地養(yǎng)活占世界22%的人口，可以說(shuō)化肥起到舉足輕重的作用 [1]。然而隨著化肥用量的不斷增加和不合理施用，由此引發(fā)的土壤質(zhì)量問(wèn)題也日益凸顯[2，3]。長(zhǎng)期大量施用化肥會(huì)對(duì)土壤理化性狀和生物學(xué)活性等產(chǎn)生惡劣影響，尤其會(huì)導(dǎo)致土壤微生物生物量和多樣性的下降[4]。

土壤微生物可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，是作物生長(zhǎng)氮、磷、鉀、鎂的重要來(lái)源[5，6]。土壤微生物受農(nóng)業(yè)田間管理的影響較大，作物輪作、施肥方式和秸稈還田等都會(huì)影響土壤微生物特性 [7-10]。

近年來(lái)，隨著有機(jī)肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量施用，在一定程度上減緩了化肥對(duì)土壤質(zhì)量的損害。然而如果將有機(jī)肥取代化肥，又遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足作物的養(yǎng)分需求[11]。有研究指出，將化肥與有機(jī)肥配合使用，可以協(xié)調(diào)養(yǎng)分供應(yīng)，滿(mǎn)足作物需求，同時(shí)減少化肥對(duì)土壤微生物活性影響[12，13]。

綠肥是最重要的有機(jī)肥之一，我國(guó)是綠肥種植最早、種植面積最大的國(guó)家 [14]。大量的科學(xué)研究表明，綠肥施用可以改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤微生物多樣性 [15]。本文利用Biolog技術(shù)，對(duì)化肥與油菜綠肥配施的5種方案引起微生物多樣性的影響進(jìn)行研究，為探討綠肥與化肥配施的最佳方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1 土壤樣品

試驗(yàn)時(shí)間起始于2002年9月，地址在河北省農(nóng)科院院內(nèi)。首先進(jìn)行6a化肥綠肥配合的定位試驗(yàn)。2008年5月取土樣，每小區(qū)取10鉆土樣，混勻風(fēng)干備用。土壤理化性質(zhì)：全氮0.093%，有機(jī)質(zhì)18.3g/kg， 速效磷21.1mg/kg，堿解氮62.8mg/kg，速效鉀130mg/kg。質(zhì)地為壤質(zhì)褐土。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

[JP2]試驗(yàn)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積3m2。共設(shè)5個(gè)處理：不施肥CK;單施化肥INORG-F：N180kg/hm2[JP2]、[JP3]P2O5 120kg/hm2、K2O 105kg/hm2;高量化肥與綠肥配施GM+FH：N 180kg/hm2、P2O5 105kg/hm2、K2O 105kg/hm2 + 油菜綠肥 22500 kg/hm2;低量化肥與綠肥配施GM+FL：N 111kg/hm2、P2O581kg/hm2、K2O 70.5kg/hm2+油菜綠肥 22500kg/hm2;中量化肥與綠肥配施GM+FM：N 171kg/hm2、P2O5 141kg/hm2、K2O 70.5kg /hm2+油菜綠肥22500kg/hm2。3次重復(fù)。試驗(yàn)作物為小麥、玉米，播種方式一年兩作。小麥播種前翻壓綠肥。[JP]

1.2 樣品處理及分析

土壤樣品風(fēng)干后過(guò)2mm 篩。其中一部分用于微生物多樣性分析，另一部分用于微生物碳、麥角固醇分析。

土壤微生物數(shù)量采用平板計(jì)數(shù)法分析。從各土壤樣品中稱(chēng)30g，置于50mL離心管中并加水調(diào)至80%田間持水量，保持23℃培育2周。然后將其稱(chēng)取1g稀釋至濃度10-4和10-6，分別測(cè)定真菌、細(xì)菌數(shù)量及多樣性;土壤全碳測(cè)定采用自動(dòng)燃爐技術(shù)測(cè)定，無(wú)機(jī)碳測(cè)定用HCL溶解、氣相色譜，全碳減去無(wú)機(jī)碳即為有機(jī)碳含量;微生物-C測(cè)定采用熏蒸提取法[16];麥角固醇按[17]方法分析。

1.3 BIOLOG微型培養(yǎng)板接種

共4種培養(yǎng)板，分別為Biolog-GN革蘭氏陰性細(xì)菌、Biolog-GP革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、Biolog-SFN真菌、Biolog-SFP真菌培養(yǎng)板。

將稀釋后的10-6土壤溶液分別吸取150μL接入微型培養(yǎng)板Biolog-SFN和Biolog-SFP，將稀釋后的10-4土壤溶液，分別吸取150μL接入微型培養(yǎng)板Biolog-GN和Biolog-GP，于23℃下培養(yǎng)，用590nm波長(zhǎng)BIOLOG讀數(shù)儀讀取3d和8d光吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行GLM分析。根據(jù)多樣性指數(shù)（H）計(jì)算公式、反應(yīng)孔數(shù)（S）、均勻指數(shù)（E）計(jì)算公式，計(jì)算出各值。

2 結(jié)果及分析

2.1 施肥對(duì)土壤微生物量的影響

表1顯示，綠肥與低量化肥GM+FL可以增加土壤有機(jī)碳量，單施化肥會(huì)使土壤有機(jī)碳量降低;對(duì)照CK的微生物碳最低，化肥、綠肥與化肥都能夠提高微生物碳量;不施肥CK與處理GM+FM麥角固醇含量最低，施肥對(duì)麥角固醇含量影響顯著，綠肥與低量化肥GM+FL處理最高;所有處理中綠肥與低量化肥GM+FL的微生物量最多，CK最少。

說(shuō)明，施肥并不減少微生物數(shù)量，加大磷肥用量減少微生物數(shù)量。低量化肥與綠肥有利于增加土壤有機(jī)碳、微生物碳、麥角固醇、微生物總量。

2.2 施肥對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌影響

2.2.1對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌多樣性和均勻度指數(shù)的影響

表2顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，不同施肥處理對(duì)反應(yīng)孔數(shù)S未見(jiàn)顯著影響，而對(duì)多樣性指數(shù)H、均勻度指數(shù)E影響顯著，不施肥CK的多樣性指數(shù)最大，綠肥與低量化肥GM+FL次之，單純化肥、綠肥與高、中量化肥配施三者較低。均勻度指數(shù)表現(xiàn)與多樣性指數(shù)表現(xiàn)相同，不施肥CK、綠肥與低量化肥GM+FL均勻度E較高。單施化肥、綠肥與高中量化肥配施均勻度E較低;培養(yǎng)8d測(cè)定，95種碳源反應(yīng)孔數(shù)S沒(méi)變化，多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)E有所下降，處理間差異不顯著。

說(shuō)明，不施肥可以提高土壤革蘭氏陰性細(xì)菌多樣性，化肥、綠肥與化肥配施會(huì)引起革蘭氏陰性細(xì)菌多樣性下降，合理的化肥綠肥配施能減緩革蘭氏陰性細(xì)菌多樣性下降。

2.2.2 對(duì)土壤革蘭氏陰性細(xì)菌利用碳源能力影響

表3顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，不同的施肥處理，對(duì)碳源利用的種類(lèi)和強(qiáng)度相差較大。綠肥與高量化肥GM+FH能夠利用AD、CD、C、M等4種碳源，CK與單施化肥能較好地利用C、CD、A、AD 4種碳源，而綠肥與中量化肥GM+FM能利用AD、C、CD、M、P 5種碳源;培養(yǎng)8d的測(cè)定，處理未見(jiàn)明顯差異，細(xì)菌利用6種碳源的強(qiáng)度增加，但是利用趨勢(shì)與3d相同。而綠肥與中量化肥GM+FM對(duì)AD、C、CD、M、P等5種碳源的利用能力較強(qiáng)，對(duì)照CK利用6種碳源的能力都較強(qiáng)。

說(shuō)明，不施肥能維持較高的土壤革蘭氏陰性細(xì)菌多樣性，綠肥與高量化肥配合可促進(jìn)利用較多種類(lèi)碳源的細(xì)菌種群的生長(zhǎng)。

2.3 施肥對(duì)土壤革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的影響

2.3.1 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多樣性和均勻度指數(shù)的影響

表4顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，不同處理對(duì)反應(yīng)孔數(shù)S、均勻度指數(shù)E未見(jiàn)顯著影響，對(duì)多樣性指數(shù)H影響顯著。不施肥CK、單施化肥處理多樣性指數(shù)較大，綠肥與低量化肥GM+FL、綠肥與高量化肥GM+FH處理較低，綠肥與中量化肥GM+FM的最大。均勻度指數(shù)E表現(xiàn)與多樣性指數(shù)H相同，不施肥和單施化肥均勻度指數(shù)較大，綠肥與低量化肥、綠肥與高量化肥較低，綠肥與中量化肥的最大。培養(yǎng)8d測(cè)定，多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)E有所下降。肥料處理對(duì)反應(yīng)孔數(shù)S的影響具有顯著差異，CK最大，綠肥與低量化肥GM+FL的S值最小。

說(shuō)明，不施肥能保持土壤革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多樣性，綠肥與化肥配施、單施化肥都將導(dǎo)致革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多樣性下降。油菜綠肥不利于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多樣性培養(yǎng)。

2.3.2 對(duì)土壤革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌利用碳源能力影響

表5所示，培養(yǎng)3d測(cè)定，各處理對(duì)P類(lèi)碳源利用的差異顯著，而對(duì)C、CD、A、AD、M碳源利用的影響不明顯，但利用碳源的種類(lèi)和強(qiáng)度明顯不同。單施化肥NORG-F能利用碳源C、CD、A、AD、M，CK、綠肥與低量GM+FL能較好利用碳源AD、CD、C、M，綠肥與中量化肥GM+FM處理能夠利用碳源CD、C、M、P，綠肥與高量化肥GM+FH能夠利用6種碳源;培養(yǎng)8d測(cè)定，各處理對(duì)6種碳源的利用強(qiáng)度增加，尤其對(duì)A類(lèi)碳源利用強(qiáng)度有顯著增強(qiáng)。單施化肥對(duì)A類(lèi)碳源的利用顯著大于其他處理。CK能較好利用6類(lèi)碳源，綠肥與低量化肥GM+FL利用AD、M碳源較好，綠肥與中量化肥GM+FM利用A、C、M等3類(lèi)碳源較好，綠肥與高量化肥GM+FH利用A、C、CD碳源較好。

說(shuō)明，化肥、綠肥與化肥配施會(huì)導(dǎo)致土壤中利用某幾種碳源的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌群生長(zhǎng)，然而多樣性會(huì)下降。這一點(diǎn)與多樣性分析是一致的，施肥多樣性低，不施肥多樣性高。

2.4 施肥對(duì)土壤SFN真菌的影響

2.4.1 對(duì)土壤SFN真菌多樣性指數(shù)等的影響。

表6顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，單施化肥、綠肥與高量化肥GM+FH較低，綠肥與低量化肥GM+FL的S值最大，但與不施肥CK、綠肥與中量化肥GM+FM差異不明顯。單施化肥多樣性指數(shù)最小，綠肥與低量化肥GM+FL的多樣性指數(shù)H最大，不施肥CK、綠肥與高量化肥GM+FH較大。均勻度指數(shù)E也表現(xiàn)出與多樣性指數(shù)H相同的趨勢(shì)，綠肥與低量化肥處理均勻度較高，但與不施肥CK、綠肥與中量化肥GM+FM的均勻度差異不明顯;培養(yǎng)8d測(cè)定，95種碳源反應(yīng)孔數(shù)S變化不明顯，多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)E與3d相比略有提高。各處理間多樣性指數(shù)H 變化顯著，不施肥CK多樣性最高，單施化肥最低，CK、綠肥與低量化肥GM+FL、綠肥與中量化肥GM+FM三者間差異不顯著。

說(shuō)明，不施肥有利于土壤SFN真菌多樣性保持，化肥、化肥與綠肥配施會(huì)導(dǎo)致土壤SFN真菌多樣性下降，綠肥與低、中量化肥配施，能維持較高的土壤SFN真菌多樣性。

2.4.2 對(duì)土壤SFN真菌利用碳源能力的影響

表7顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，土壤SFN真菌對(duì)不同碳源利用受處理影響不顯著。從趨勢(shì)看，綠肥與低量化肥GM+FL對(duì)6類(lèi)碳源利用能力最高;培養(yǎng)8d的測(cè)定，土壤SFN真菌對(duì)6種碳源的利用強(qiáng)度明顯高于3d，各處理對(duì)A類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度影響顯著，對(duì)其他5類(lèi)影響不明顯。綠肥配施中量化肥GM+FM利用A的強(qiáng)度最高（這可能與磷肥用量高有一定的關(guān)系），不施肥CK次之，單施化肥處理較低。綠肥與中量化肥GM+FM和CK利用6類(lèi)碳源的能力都強(qiáng)。綠肥與高量化肥GM+FH對(duì)6類(lèi)碳源的利用能力最低。

說(shuō)明，綠肥與高量化肥配施不利于土壤SFN真菌多樣性培育，不施肥有利于SFN真菌多樣性培育。增加磷肥用量可能有利于SFN真菌多樣性培育，氮肥可能不利于SFN真菌多樣性培育。

2.5 施肥對(duì)土壤 SFP真菌的影響

2.5.1 對(duì)土壤SFP真菌多樣性指數(shù)等的影響

表8顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，各處理對(duì)反應(yīng)孔數(shù)S、多樣性指數(shù)H影響不明顯。綠肥與高量化肥GM+FH的S值最大，CK最低;綠肥與高量化肥配合GM+FH的多樣性指數(shù)H值最高，單施化肥最低。各處理對(duì)均勻度指數(shù)E影響顯著，綠肥與低量化肥GM+FL的E值最大，但與其他處理沒(méi)有明顯差異;培養(yǎng)8d測(cè)定，反應(yīng)孔數(shù)S沒(méi)發(fā)生變化，多樣性指數(shù)H和均勻度指數(shù)E比3d有很大提高。各處理對(duì)反應(yīng)孔數(shù)S、均勻度指數(shù)E影響不顯著，但對(duì)多樣性指數(shù)H影響顯著。綠肥與中量化肥GM+FM的多樣性指數(shù)最大，單施化肥最低， CK較高，不施肥、綠肥與低量化肥、綠肥與高量化肥3者差異不顯著。

說(shuō)明，綠肥與中量化肥配施能提高土壤SFP真菌多樣性，單施化肥SFP真菌多樣性會(huì)下降，不施肥維持較高的SFP真菌多樣性。增施磷肥能增加土壤SFP真菌的多樣性。

2.5.2 對(duì)土壤SFP真菌碳源利用能力的影響

表9顯示，培養(yǎng)3d測(cè)定，各處理對(duì)土壤SFP型真菌利用6種碳源的能力影響不顯著。從代謝強(qiáng)度看，各施肥處理利用碳源能力，都比不施肥CK大。不同處理利用碳源種類(lèi)也存在差異，綠肥與中量化肥GM+FM利用種類(lèi)多、強(qiáng)度大，CK、綠肥與高量化肥GM+FH處理能較好利用AD、CD、C、M碳源，綠肥與低量化肥GM+FL對(duì)6類(lèi)碳源利用較高。培養(yǎng)8d測(cè)定，土壤SFP真菌對(duì)6種碳源利用強(qiáng)度明顯要高于3d，各處理對(duì)M類(lèi)碳源的利用強(qiáng)度影響明顯，而對(duì)其它5類(lèi)碳源影響不明顯。綠肥與低量化肥GM+FL利用6種碳源的能力最高，其中M達(dá)到顯著差異。

說(shuō)明，綠肥與化肥配施能促進(jìn)多種碳源的土壤SFP真菌生長(zhǎng)，單施化肥引起利用各種碳源真菌群的下降，CK利用碳源種類(lèi)較少，不利于SFP真菌的生長(zhǎng)。

3 討論

[HTH][STHZ]3.1 單施化肥[HT] 與不施肥相比，土壤微生物總量的提高不明顯，卻明顯限制了土壤中細(xì)菌和真菌多樣性。劉武星等[18-20]研究發(fā)現(xiàn)，不施肥能夠提高土壤中革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌多樣性，施用化學(xué)肥料能導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性的下降，合理的化肥與綠肥配合施用能夠減緩?fù)寥兰?xì)菌多樣性的下降;這些觀(guān)點(diǎn)與本研究基本相符。

綠肥與化肥配施，可以明顯提高土壤微生物總量。田偉等[21]研究表明，綠肥施用能夠顯著提高土壤微生物數(shù)量。萬(wàn)水霞等[22]研究證明長(zhǎng)期施用紫云英可以提高土壤微生物總量58.09%～86.86%。佀國(guó)涵等[23]研究也認(rèn)為，綠肥和化肥配施，明顯提高了土壤細(xì)菌、AM真菌及微生物總量。

[HTH][STHZ]3.2 低量化肥[HT] 與綠肥配施會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌多樣性降低，但可以維持較高真菌的多樣性;高量化肥與綠肥配施有利于革蘭氏陰性細(xì)菌的多樣性，但不利于SFN真菌多樣性。孟慶杰等[24]研究表明施肥會(huì)影響土壤細(xì)菌多樣性，不施肥細(xì)菌多樣性高，化肥有機(jī)肥配施次之，單施化肥最低。Elfstrand S等[25]研究揭示，施用有機(jī)肥可以明顯促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)。

[HTH][STHZ]3.3 氮肥不利[HT] 于真菌多樣性培育，適當(dāng)增施磷肥有利于土壤真菌多樣性提高，但會(huì)導(dǎo)致微生物總量降低。這一點(diǎn)目前有分歧，如張成霞等[26]認(rèn)為長(zhǎng)期施用磷肥會(huì)增加土壤微生物量;而張彥東[27，28]等研究認(rèn)為施用磷肥后，土壤微生物量增加并不明顯，磷不是影響土壤微生物的主要因素。有些研究則將化肥對(duì)土壤微生物影響傾向于均衡營(yíng)養(yǎng)的論點(diǎn)，指出如果有些養(yǎng)分因長(zhǎng)期得不到滿(mǎn)足就會(huì)成為限制因子，如長(zhǎng)期氮處理或氮鉀處理，磷就會(huì)成為限制因子，長(zhǎng)期磷鉀肥處理，氮可能就成為限制因子，限制因子養(yǎng)分豐缺程度不同，就會(huì)影響土壤微生物的數(shù)量[29]。

4 結(jié)論

低量化肥與綠肥配施有利于增加土壤有機(jī)碳、微生物碳、麥角固醇以及微生物數(shù)量。

不施肥能夠提高土壤革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌的多樣性，使用化肥、綠肥與化肥配施都引起土壤革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌多樣性的下降，只有合理的化肥與綠肥配施，才能夠減緩?fù)寥栏锾m氏陰性細(xì)菌多樣性下降的速度。綠肥與高量化肥配施能夠刺激和促進(jìn)利用較多種類(lèi)碳源的細(xì)菌種群的生長(zhǎng)與發(fā)育。油菜作為綠肥不利于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多樣性的保持與培養(yǎng)。

不施肥、綠肥與低、中量化肥有利于土壤SFN真菌多樣性的保持，化肥、高量化肥與綠肥配施會(huì)導(dǎo)致土壤SFN真菌多樣性下降。增加磷肥用量導(dǎo)致微生物總量下降，但有利于SFN真菌真菌多樣性提高，氮肥對(duì)SFN真菌真菌多樣性產(chǎn)生不良效果。

不施肥處理會(huì)使土壤SFP真菌利用碳源種類(lèi)較少，不利于生長(zhǎng)。綠肥與中量化肥能夠提高SFP真菌的多樣性，磷肥可能是SFP真菌多樣性增加的重要因素。單施化肥會(huì)引起利用各種碳源SFP真菌多樣性下降，適量綠肥與化肥配施能增加利用多種碳源的真菌生長(zhǎng)。

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作者簡(jiǎn)介：

閆庚戌（1970-），男，本科，高級(jí)農(nóng)藝師。研究方向：蔬菜技術(shù)推廣與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè);

范丙全（1956-），男，博士生導(dǎo)師，研究員。研究方向：土壤微生物與農(nóng)業(yè)微生物資源利用。