增齡對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4的影響

林運(yùn)靈

[摘要] 目的 探討增齡對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后TLR-4及相關(guān)炎癥因子的影響。方法 選取該院于2018年1—6月間實(shí)驗(yàn)室以青年（3月齡）及老年（18月齡）清潔級(jí)健康雄性SD大鼠建立心肌缺血再灌注模型，依據(jù)鼠齡分為：①假手術(shù)青年組（Sham-Y組）及假手術(shù)老年組（Sham-A）;②心肌缺血再灌注青年組（IR-Y組）及心肌缺血再灌注老年組（IR-A組）。檢測(cè)大鼠心肌梗死面積、炎癥因子變化，蛋白電泳分析TLR-4表達(dá)的變化。結(jié)果 與Sham-Y組相比， Sham-A組TNF-α（30.1±5.3）ng/mL、IL-6水平（34.2±3.7）pg/mL顯著增高（P<0.05）;缺血再灌注后，與IR-Y組相比，IR-A組心肌梗死面積顯著增大;與IR-Y組相比，IR-A組血清TNF-α（421.2±56.9）ng/mL、IL-6水平（129.3±11.5）pg/mL顯著增高（P<0.05），血清IL-10水平（48.2±4.1）pg/mL顯著減低（P<0.05）;與IR-Y組相比，IR-A組TLR-4表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 增齡導(dǎo)致心肌缺血再灌注后心肌TLR-4及其相關(guān)炎癥因子表達(dá)增強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 心肌缺血再灌注損傷;Toll樣受體;炎癥

[中圖分類號(hào)] R54? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）09（c）-0008-03

[Abstract] Objective To observe the effects of aging on TLR-4 and related inflammatory factors after myocardial ischemia-reperfusion in rats. Methods The model was established in the laboratory from January to June 2018. The model of myocardial ischemia-reperfusion was established in young （3 months old） and old （18 months old） clean-grade healthy male SD rats， 1.sham-operated group （Sham-Y group） and sham-operated group （Sham-A）; 2.myocardial ischemia-reperfusion group （IR-Y group） and myocardial ischemia-reperfusion group （IR-A group）. The myocardial infarct size and inflammatory factors were detected in rats， and the expression of TLR-4 was analyzed by protein electrophoresis. Results Compared with Sham-Y group， TNF-α （30.1±5.3）ng/mL and IL-6 level（34.2±3.7）pg/mL were significantly increased in Sham-A group （P<0.05）. After ischemia-reperfusion， compared with the IR-Y group， the area of myocardial infarction in the IR-A group was significantly increased; compared with the IR-Y group， the serum TNF-α（421.2±56.9） ng/mL and IL-6 levels in the IR-A group （129.3±11.5）pg/mL was significantly increased （P<0.05）， serum IL-10 level （48.2±4.1） pg/mL was significantly decreased （P<0.05）; IR-A group TLR-4 expression was significantly enhanced compared with IR-Y group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Age-induced myocardial TLR-4 and its related inflammatory factors are enhanced after myocardial ischemia and reperfusion.

[Key words] Myocardial ischemia-reperfusion injury; Toll-like receptor; Inflammation

心血管病仍然是人口首位死亡原因[1]，受老齡化的影響，心血管病患病及死亡的絕對(duì)人數(shù)仍在持續(xù)上升[2]，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。與青年人相比，老年人心血管病預(yù)后更差。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與青年小鼠相比，老齡小鼠在心肌梗死后梗死區(qū)域擴(kuò)展更為嚴(yán)重，心功能更差[3];諸多有效的干預(yù)措施如缺血后處理等在老年動(dòng)物心臟也喪失其保護(hù)作用[4]。老年心臟對(duì)損傷的易感性的機(jī)制仍未得到闡明。

心梗后炎癥反應(yīng)為心臟修復(fù)所必需，TLR（Toll-like receptor，TLR）介導(dǎo)的內(nèi)源性免疫反應(yīng)是心肌缺血再灌注后炎癥反應(yīng)的重要組成部分。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制Toll樣受體-4（TLR-4）的表達(dá)能夠顯著減輕梗死心肌炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷[5]。目前尚不清楚，衰老對(duì)心肌缺血再灌注后TLR-4及其相關(guān)炎癥通路信號(hào)分子表達(dá)是否有影響。

該研究選取2018年1—6月間該院實(shí)驗(yàn)室參與實(shí)驗(yàn)的小鼠為研究對(duì)象，旨在通過對(duì)3月齡及18月齡大鼠建立心肌缺血再灌注模型，觀察衰老對(duì)心臟TLR-4及其下游炎癥信號(hào)分子的變化，探討TLR-4在衰老大鼠心肌缺血后的作用及其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

2月齡清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley大鼠（180～200 g），自由飲食，動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。待各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別飼養(yǎng)至3月齡、18月齡，分別進(jìn)入假手術(shù)及心肌缺血再灌注組。該研究分組：①假手術(shù)組（Sham組）：只穿線不結(jié)扎，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物月齡再分為青年組（Sham-Y組）及老年組（Sham-A組）;②心肌缺血再灌注組（IR組）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物月齡再分為青年組（IR-Y組）及老年組（IR-A組），每組動(dòng)物8只。研究步驟詳見動(dòng)物模型建立部分。

1.2? 試劑、儀器

氯化三苯基四氮唑（TTC）：美國(guó)Amresco 公司;伊文氏藍(lán)：Sigma公司;美國(guó)RD公司TNF-α、IL-6、IL-10? ELISA試劑盒分別購(gòu)于USCN及R&D公司; TLR-4 多克隆抗體及MyD88多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。其余試劑為市售分析純產(chǎn)品。BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司;小動(dòng)物呼吸機(jī)（TKR-200C）：江蘇特力麻醉呼吸設(shè)備公司; Mini Trans-Bloe電泳儀（Bio.Rad公司，美國(guó)），全自動(dòng)凝膠圖象分析儀（Syngene公司，美國(guó)）， Image.Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國(guó)）。

2? 動(dòng)物模型建立及指標(biāo)檢測(cè)

2.1? 大鼠心肌缺血再灌注模型制備

缺血再灌注組以穿線結(jié)扎法結(jié)扎左冠脈建立大鼠缺血-再灌注模型[6]。缺血30 min后，松開絲線恢復(fù)血流，缺血心肌顏色從暗紅變?yōu)轷r紅，心電圖顯示抬高的ST段下降1/2，說明再灌注成功，逐層關(guān)胸。在大鼠出現(xiàn)吞咽動(dòng)作后，拔除氣管導(dǎo)管，放入籠中，繼續(xù)保溫，蘇醒后自由飲水進(jìn)食。假手術(shù)對(duì)照組動(dòng)物模型復(fù)制方法同上，但只穿線但不收緊線。

2.2? 檢測(cè)指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.2.1? 心梗面積測(cè)定? 心肌缺血區(qū)和心肌梗死范圍的測(cè)定按照既往方案進(jìn)行，計(jì)算梗死區(qū)（ infarct size， IS）心肌與危險(xiǎn)區(qū)（area at risk，AAR）心肌重量的比值IS/AAR，用以表示心肌梗死范圍的大小。心肌缺血區(qū)范圍用心肌缺血區(qū)重量占左心室重量百分比（AAR/LV）表示。心肌梗死范圍用心肌梗死區(qū)重量占心肌缺血區(qū)重量百分比（IS/AAR）表示。

2.2.2? 血清TNF-α、IL-6、IL-10含量檢測(cè)? 處死前取靜脈血1 mL，放入含乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的EP管中，混勻后1 400×g離心15 min，取血漿-20℃保存。待標(biāo)本收集齊后，于4℃冰箱自然解凍，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)血清TNF-α、IL-6、IL-10的濃度。

2.2.3? Westernblot檢測(cè)心肌TLR-4、MyD88表達(dá)? 于再灌注7 d處死動(dòng)物，取保存的心肌組織加入適當(dāng)液氮研磨后，加入細(xì)胞裂解液，充分作用后于100℃加熱，12 000 g/min離心10 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度（根據(jù)樣品濃度調(diào)整上樣蛋白量為50 μg/孔），經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，脫脂奶粉封閉，加入1： 1000稀釋的一抗，4℃過夜，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，X線膠片壓片，顯影、定影，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶的吸光面積積分比值來(lái)評(píng)定其蛋白表達(dá)水平。

3? 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（Levene檢驗(yàn)）及正態(tài)性檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)）。符合正態(tài)分布組間比較采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較，方差齊者采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用Game-Howell檢驗(yàn);但若數(shù)據(jù)屬于非正態(tài)分布，則采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 各組心肌缺血與心肌梗死面積比較

青年組及老年組心肌缺血面積之間[（45.0±3.2）% vs （47.8±4.2）%]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.16，P>0.05）。在心肌缺血再灌注后，與青年組（IR-Y組）相比，老年組（IR-A組）心肌梗死面積顯著增大（42.8±3.4）% vs （55.4±5.1）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=16.368， P<0.05）。

4.2? 各組血清TNF-α、IL-6、IL-10含量比較

與假手術(shù)組相比，心肌缺血再灌注后，心肌再灌注組血清炎癥因子含量明顯增高。與Sham-Y組相比，Sham-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。如表1所示，與IR-Y組相比，IR-A組血清TNF-α及IL-6水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;IR-A組IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4.3? 各組心肌TLR-4、MyD88含量比較

如圖1所示，與假手術(shù)組相比，心肌缺血再灌注組大鼠心肌TLR-4、MyD88表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與Sham-Y組相比，Sham-A組心肌TLR-4、MyD88水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）與IR-Y組相比，IR-A組TLR-4、MyD88表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。