IL-10對(duì)體外培養(yǎng)胚胎大鼠中腦NSCs增殖分化的影響

嚴(yán)繼貴 (安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理學(xué)部 藥學(xué)系，安徽 合肥 230601)

趙正梅，盛夕曼 (安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校護(hù)理學(xué)部，安徽 合肥 230601)

楊宇清 (安徽醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 合肥 230601)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)具有無(wú)限增殖、分化及遷移的特性，既可直接用于干細(xì)胞移植，亦可作為基因治療的載體。目前，NSCs移植研究多集中于腦部疾病，移植的NSCs經(jīng)增殖與分化后，補(bǔ)充、替換和修復(fù)死亡及損傷的腦細(xì)胞[1]，以期治愈腦部疾患。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)NSCs不僅具有神經(jīng)再生、結(jié)構(gòu)修補(bǔ)或替代、神經(jīng)重塑、神經(jīng)保護(hù)等作用[2～4]，其治療范圍亦不局限于腦損傷。有學(xué)者經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植NSCs修復(fù)大鼠脊髓損傷及治療坐骨神經(jīng)痛[5]，也就是說(shuō)NSCs移植在治療神經(jīng)病理性疼痛方面有一定作用。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種抗炎因子，能有效減輕腦損傷的炎癥反應(yīng)，既能為NSCs移植提供較好的微環(huán)境，又能減輕炎癥對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的刺激作用[6]。故本實(shí)驗(yàn)將IL-10與胎鼠中腦NSCs共培養(yǎng)，體外觀察其對(duì)NSCs增殖與分化的影響，并通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)等相關(guān)指標(biāo)，以探討其可能的作用機(jī)制，為后續(xù)應(yīng)用IL-10-NSCs移植治療神經(jīng)病理性疼痛等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

孕14d清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。重組人IL-10購(gòu)自美國(guó)Promega公司，高糖DMEM/F12、特級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司，N2添加劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，堿性成纖維蛋白因子(basic-fibroblast growth factor，b-FGF)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗caspase-3多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(PR-0284)，抗nestin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(ab6142)，兔抗NSE多克隆抗體(bs-1027R)、兔抗GFAP多克隆抗體(bs-0199R)購(gòu)自北京博奧森有限公司， FITC標(biāo)記的兔抗大鼠多克隆抗體(BA1108)、Cy3標(biāo)記的大鼠抗兔多克隆抗體(BA1032)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)WTCBinder公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠，GIS-2020凝膠圖像處理系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司，倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)(ECLIPSE Ts2)購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分4組：空白對(duì)照組；高劑量組：IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為100μg/L；中劑量組：IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為50μg /L；低劑量組：IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10μg/L。

1.2.2 胎鼠中腦NSCs培養(yǎng)、傳代、分化

將孕14d的SD胎鼠中腦制成單細(xì)胞懸液，置于無(wú)血清培養(yǎng)基(含1%N2的DMEM/F12)中懸浮培養(yǎng)，種植密度為1×106/mL，隔天半量換液，每日按10ng/mL添加bFGF，余同中腦神經(jīng)元培養(yǎng)。5d后用1mL移液器輕輕吹打10～15次，將懸液按800rpm離心8min。半量去上清，再吹打10～15次，行傳代培養(yǎng)。另在24孔培養(yǎng)板中鋪滿(mǎn)已包被多聚賴(lài)氨酸(poly-l-lycine，PLL)的蓋玻片，將剩余NSCs懸液移入其中，半量加入DMEM/F12分化液(含10%FBS)，24h后加入全量分化液，培養(yǎng)1周后行免疫熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組在增殖、傳代及分化培養(yǎng)中IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)保持不變。

在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球的生長(zhǎng)狀況，邊緣整齊否、有無(wú)光暈；臺(tái)盼藍(lán)染色觀察NSCs活力及傳代次數(shù)；誘導(dǎo)分化后神經(jīng)球貼壁時(shí)間、分化狀況。

1.2.3 免疫熒光染色及圖像分析

每個(gè)指標(biāo)，每組對(duì)應(yīng)任取6孔細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，PBS洗5min，連續(xù)洗3次。加入4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次(5min/次)后，用0.4%TritonX-100透膜10min，加入封閉液封閉15min，分別滴加一抗nestin(1∶400)、Caspase-3(1∶50)、NSE(1∶75)、 GFAP(1∶200)，4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5min；滴加FITC標(biāo)記的兔抗大鼠多克隆抗體和Cy3標(biāo)記的大鼠抗兔多克隆抗體，避光孵育1h，PBS洗3次(5min/次)，再用蒸餾水洗10min，甘油封片。每組取6張玻片，熒光顯微鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野進(jìn)行拍照，使用Image-Pro Plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件分析神經(jīng)球和陽(yáng)性細(xì)胞的累積光密度值(IOD)值。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NSCs培養(yǎng)、傳代及誘導(dǎo)分化

培養(yǎng)24h即見(jiàn)神經(jīng)球，3d后其邊緣整齊晶瑩透亮，活力好(圖1(a))。傳代培養(yǎng)結(jié)果顯示，高、中劑量組NSCs可傳5代，高劑量組細(xì)胞活力(p5=67%)高于中劑量組(p5=51%)，另2組可傳3代。加入血清24h神經(jīng)球貼壁，48h有分化細(xì)胞長(zhǎng)出(圖1(b))，1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高(圖1(c))，低劑量組次之，對(duì)照組最差。

2.2 加入IL-10促進(jìn)NSCs增殖及向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化

免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)球呈nestin陽(yáng)性染色(圖1(d))，即表達(dá)NSCs特異性標(biāo)記物nestin蛋白；IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為100μg/L的高劑量組神經(jīng)球nestin表達(dá)量最大(1943574.61±324851.45)，與中、低劑量組及對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為50μg/L的中劑量組(1122378.63±553472.08)和IL-10質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10μg/L低劑量組(1087813.92±534776.30)神經(jīng)球nestin表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但2組分別與對(duì)照組(490071.02±181824.56)相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表1)。加入IL-10后，體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠中腦NSCs增殖顯著。凋亡基因蛋白Caspase-3的表達(dá)以對(duì)照組(2351253.00±101321.54，與其他3組相比作用最強(qiáng)(圖2(d))，高劑量組與中劑量組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見(jiàn)圖2(a)、(b))，低劑量組Caspase-3的表達(dá)(1325947.90±181482.68)與其余3組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表1、圖2(c))。高、中、低劑量組NSCs增多可能與抑制凋亡基因Caspase-3表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能是加入IL-10后，通過(guò)某種特定路徑抑制了Caspase-3的表達(dá)。

注： (a)原代培養(yǎng)3d的神經(jīng)球；(b)貼壁培養(yǎng)48h的神經(jīng)球；(c)貼壁培養(yǎng)1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高；(d)呈nestin染色陽(yáng)性的神經(jīng)球。Bars=50μm in (a～d)。圖1 各組NSCS體外培養(yǎng)和分化

組別Nestin/1 Caspase-3 /1對(duì)照組490071.02±181824.562351253.00±101321.54高劑量組1943574.61±324851.45a848715.63±64934.77a中劑量組1122378.63±553472.08ab935672.52±403184.70a低劑量組1087813.92±534776.30ab1325947.90±181482.68abc

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a)高劑量組Caspase-3表達(dá)很弱；(b) 中劑量組Caspase-3表達(dá)亦很弱；(c) 低劑量組Caspase-3表達(dá)較強(qiáng)；(d)對(duì)照組Caspase-3表達(dá)最強(qiáng)。Bars=50μm in (a～d)。圖2 各組凋亡基因蛋白Caspase-3的表達(dá)

GFAP染色顯示，高劑量組表達(dá)最強(qiáng)(103343478.30±11652062.31)(見(jiàn)圖3(a))，中劑量組次之(79390065.33±12071396.27)(見(jiàn)圖3(b))，低劑量組較弱(49261482.33±17002176.95)(見(jiàn)圖3(c))，對(duì)照組最弱(21470592.54±10412377.04)(見(jiàn)圖3(d))，各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見(jiàn)表2)。加入IL-10后，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠NSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，并呈濃度依賴(lài)性。由表2及圖4可以看出，各組NSE染色并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。加入IL-10后，對(duì)體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠NSCs向神經(jīng)元方向分化無(wú)明顯影響。

注： (a) 高劑量組GFAP表達(dá)最強(qiáng)；(b) 中劑量組GFAP表達(dá)較強(qiáng)；(c) 低劑量組GFAP表達(dá)較弱(d)對(duì)照組GFAP表達(dá)最弱。Bars=50μm in (a～d)。圖3 各組GFAP表達(dá)情況

表2 各組神經(jīng)球分化后GFAP、NSE陽(yáng)性細(xì)胞IOD值比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a) 高劑量組、(b) 中劑量組、(c) 低劑量組、(d)對(duì)照組NSE陽(yáng)性染色細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Bars=50μm in (a～d)。圖4 各組NSE陽(yáng)性染色細(xì)胞

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細(xì)胞，具有無(wú)限增殖、分化、遷移、趨化和低免疫原的生物特性[7]。干細(xì)胞的多潛能和自我更新特性賦予其在缺血、變性條件下以及創(chuàng)傷中再生丟失組織的能力，以幫助減輕腦損傷及改善腦損傷后的功能[8, 9]。研究表明，移植誘導(dǎo)分化的神經(jīng)干細(xì)胞的治療效果優(yōu)于直接移植未經(jīng)分化的神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化為不同階段的神經(jīng)細(xì)胞再用于移植時(shí)，可顯著降低成瘤風(fēng)險(xiǎn)[10～13]。目前，NSCs的應(yīng)用不僅僅局限于移植治療腦損傷疾患，Sacco等[14]認(rèn)為通過(guò)移植NSCs有可能治愈神經(jīng)精神類(lèi)疾病，并推測(cè)神經(jīng)發(fā)育障礙的原因是NSCs增殖與分化的失衡所致。Ebrahim等[15]將體細(xì)胞重新編程轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)出所需NSCs，利用直接轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)分化過(guò)程，繞過(guò)多能狀態(tài)，從而減少腫瘤發(fā)生和遺傳不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)。盡管如此，NSCs的臨床應(yīng)用仍面臨諸多難題，如何調(diào)控NSCs增殖，如何誘導(dǎo)NSCs定向分化成目標(biāo)細(xì)胞，如何減輕腦損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)對(duì)移植NSCs造成的影響等。

IL-10是Ⅱ型輔助T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，不僅在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，還是調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌的主要因子[16]。當(dāng)中樞神經(jīng)損傷時(shí)，IL-10能降低過(guò)度而有害的免疫應(yīng)答，并能激活浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，削弱膠質(zhì)瘢痕生長(zhǎng)，促進(jìn)受損的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)[17]。而IL-10基因敲除的大鼠在永久性大腦中動(dòng)脈梗死后死亡率明顯增加[18]。因此，眾多學(xué)者在研究NSCs移植時(shí)想方設(shè)法提高IL-10的分泌水平，以減輕腦損傷的炎癥反應(yīng)，從而創(chuàng)造出利于移植NSCs增殖分化的微環(huán)境。Zhang等[19]將NSCs與IL-10制成混懸液進(jìn)行移植，以降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。Xu等[20]將NSCs誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元，并加入白細(xì)胞抑制因子(LIF)，通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)途徑，促進(jìn)IL-10分泌，從而改善神經(jīng)元的存活?？梢?jiàn)，在NSCs移植應(yīng)用研究中IL-10愈來(lái)愈受到重視。筆者將IL-10與NSCs共培養(yǎng)，通過(guò)檢測(cè)NSCs、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物nestin、NSE和GFAP來(lái)觀察其增殖及分化情況。另外凋亡基因Caspase-3表達(dá)量的比較可以判斷凋亡對(duì)NSCs存活率的影響[21]。結(jié)果表明，IL-10能顯著促進(jìn)NSCs增殖，一方面與其內(nèi)在的分子機(jī)制相關(guān)，另一方面可能與抑制Caspase-3表達(dá)相關(guān)，減少了NSCs凋亡的發(fā)生。同時(shí)，IL-10能促進(jìn)NSCs向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化，但對(duì)其向神經(jīng)元方向分化作用不顯。

綜上所述，IL-10不僅能減輕腦損傷的炎癥反應(yīng)，為移植NSCs創(chuàng)造有利的微環(huán)境，還能促進(jìn)NSCs增殖，并影響NSCs的分化。下一步將構(gòu)建表達(dá)IL-10的NSCs，進(jìn)行體內(nèi)移植，并進(jìn)一步研究IL-10 影響NSCs增殖分化的具體分子機(jī)制，為后續(xù)應(yīng)用IL-10-NSCs移植治療神經(jīng)病理性疼痛提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。