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    利用剩余活性污泥合成聚羥基脂肪酸酯的研究進(jìn)展

    2019-12-09 13:08:08孟棟李枘枘劉玉玲樊祥宇黃兆松古鵬飛李強(qiáng)
    生物工程學(xué)報(bào) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:活性污泥酸化碳源

    孟棟,李枘枘,劉玉玲,樊祥宇,黃兆松,古鵬飛,李強(qiáng)

    綜 述

    李強(qiáng) 濟(jì)南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副院長,教授、博士生導(dǎo)師,中國微生物學(xué)會(huì)終身會(huì)員,山東微生物學(xué)會(huì)理事,長期從事資源與環(huán)境微生物學(xué)相關(guān)研究。先后主持承擔(dān)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目3項(xiàng)、省部級(jí)項(xiàng)目4項(xiàng)。在、、等主流學(xué)術(shù)刊物發(fā)表科研論文30余篇,其中SCI收錄20余篇。作為第一完成人獲授權(quán)國家發(fā)明專利5項(xiàng),獲中國商業(yè)聯(lián)合會(huì)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)、山東省高校優(yōu)秀科研成果二等獎(jiǎng)1項(xiàng)。

    利用剩余活性污泥合成聚羥基脂肪酸酯的研究進(jìn)展

    孟棟,李枘枘,劉玉玲,樊祥宇,黃兆松,古鵬飛,李強(qiáng)

    濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250022

    利用單一微生物發(fā)酵是現(xiàn)階段獲得聚羥基脂肪酸酯 (PHA) 的主要方式,但過高的生產(chǎn)成本限制了其大規(guī)模應(yīng)用。近年來利用活性污泥菌群混合培養(yǎng)合成PHA被廣泛研究。將剩余污泥處理與PHA合成相結(jié)合,不僅可以省去純培養(yǎng)所必需的滅菌環(huán)節(jié),同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)剩余污泥的資源化利用。剩余污泥的水解酸化、菌群富集馴化及PHA合成受環(huán)境因素影響,深入的生物合成機(jī)制研究有助于混合培養(yǎng)合成PHA的推廣應(yīng)用。文中主要介紹利用剩余污泥合成PHA的可行性、影響剩余污泥水解酸化的因素、污泥菌群富集馴化合成PHA及其機(jī)制等方面的研究進(jìn)展。

    聚羥基脂肪酸酯,活性污泥,揮發(fā)性脂肪酸,微生物混合培養(yǎng)

    隨著“白色污染”帶來的問題愈發(fā)嚴(yán)重,尋找石油基塑料的替代產(chǎn)品迫在眉睫。聚羥基脂肪酸酯 (PHA) 可在自然條件下被微生物完全降解,具有與石油基塑料產(chǎn)品相似的物理化學(xué)性質(zhì),使其成為一種潛在的替代產(chǎn)品,可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、建筑、制藥及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[1-2]。利用單一微生物發(fā)酵是現(xiàn)階段獲得PHA的主要方式。雖然產(chǎn)量較高,但昂貴的發(fā)酵底物及發(fā)酵過程需保持無菌條件使其生產(chǎn)成本至少是傳統(tǒng)塑料的3倍以上[3]。因此尋找低成本的生產(chǎn)方式成為PHA研究領(lǐng)域的重點(diǎn)方向。利用活性污泥微生物混合培養(yǎng)發(fā)酵合成PHA無需保持無菌條件,且污泥本身經(jīng)水解酸化可以產(chǎn)生廉價(jià)碳源,有望解決合成PHA成本較高的問題。

    1 利用剩余污泥合成PHA的可行性

    活性污泥法是目前應(yīng)用最廣泛的污水生物處理技術(shù),缺點(diǎn)是產(chǎn)生大量的剩余活性污泥亟待處理。根據(jù)《“十三五”全國城鎮(zhèn)污水處理及再生利用設(shè)施建設(shè)規(guī)劃》[4](以下簡稱“《規(guī)劃》”) 數(shù)據(jù)顯示,截止2015年底我國污水處理能力達(dá)2.17億m3/d,約產(chǎn)生污泥13萬t/d,而污泥無害化處置規(guī)模僅為3.74萬t/d。因此《規(guī)劃》中特別強(qiáng)調(diào),“十三五”期間國家“鼓勵(lì)采用能源化、資源化技術(shù)手段,盡可能回收利用污泥中的能源和資源”。

    Wallen等[5]首次報(bào)道活性污泥中的微生物可以積累PHA,揭開了利用剩余活性污泥這種廢棄物資源合成PHA的序幕。2014年Van等[6]在上撰文指出了未來的污水處理廠利用剩余活性污泥菌群合成PHA的重要意義。Pittmann等[7]通過論證在德國或歐洲其他國家的污水處理廠進(jìn)行PHA生產(chǎn)的可行性,認(rèn)為全歐洲的污水處理廠可以生產(chǎn)出全球目前生物聚合物產(chǎn)量1.15倍的產(chǎn)品,因此利用污水處理活性污泥規(guī)模化生產(chǎn)PHA的潛力巨大。

    Valentino等[8]提出可以將利用活性污泥生產(chǎn)PHA與污水處理過程結(jié)合,產(chǎn)PHA的同時(shí)可以減少活性污泥的產(chǎn)量,這一過程主要是通過將有機(jī)固體轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸 (VFAs) 來實(shí)現(xiàn),而VFAs可以作為PHA的合成原料。在經(jīng)濟(jì)上切實(shí)可行的利用剩余污泥菌群混合培養(yǎng)發(fā)酵合成PHA主要包括3個(gè)過程:1) 底物準(zhǔn)備階段:含大分子有機(jī)物的廢水或剩余污泥經(jīng)水解酸化生成VFAs;2) 產(chǎn)PHA菌群富集階段:通過馴化污泥將具有合成PHA能力的菌群富集;3) PHA合成階段:經(jīng)馴化富集的污泥菌群利用VFAs合成PHA[9]。

    2 剩余污泥水解酸化的影響因素

    剩余污泥厭氧水解酸化生成的VFAs主要是由6個(gè)或者更少的碳原子組成的短鏈脂肪酸,該反應(yīng)一般在序批式反應(yīng)器 (SBR) 中進(jìn)行。研究表明以下若干因素會(huì)對(duì)生成VFAs的濃度及組成有較大影響。

    2.1 溫度對(duì)水解酸化的影響

    溫度對(duì)厭氧消化底物中組分的物化特性有重要影響,同時(shí)還影響微生物的生長速率與代謝,從而使反應(yīng)器中的種群動(dòng)態(tài)發(fā)生變化[10]。Yuan等[11]研究表明在24.6 ℃條件下VFAs最高產(chǎn)量為 2 154 mg/L,而在嗜冷范圍14 ℃和4 ℃條件下VFAs產(chǎn)量分別為1 449 mg/L和782 mg/L,但在這3種不同溫度下產(chǎn)生的VFAs的組成并沒有顯著的變化。Liu等[12]發(fā)現(xiàn),在最佳pH下總VFAs的積累在嗜熱 (55 ℃) 條件下最高,是嗜溫 (35 ℃) 條件下的2倍,是嗜高溫 (70 ℃) 條件下VFAs積累量的1.12倍。另外,Hao等[13]的研究也證明了55 ℃條件下VFAs產(chǎn)量高,厭氧發(fā)酵VFAs的積累量是嗜溫條件的10倍。通過以上研究表明,55 ℃左右的嗜熱條件是水解酸化的最適溫度。

    2.2 pH對(duì)水解酸化的影響

    由于大多數(shù)的產(chǎn)酸微生物在強(qiáng)酸 (pH<3) 和強(qiáng)堿 (pH>12) 環(huán)境下不能生存,因此控制反應(yīng)器中的pH對(duì)于VFAs的生產(chǎn)非常重要[14]。在酸性和堿性環(huán)境下,產(chǎn)酸微生物均能夠進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸。在堿性條件下,污泥中胞外聚合物帶電基團(tuán)的電離會(huì)促進(jìn)污泥水解,并導(dǎo)致胞外聚合物之間的強(qiáng)排斥,從而使碳水化合物和蛋白質(zhì)釋放到環(huán)境中。同時(shí)堿性條件還能夠防止生成的VFAs消耗形成甲烷[15]。Liu等[12]研究了不同pH條件對(duì)VFAs生產(chǎn)的影響,發(fā)現(xiàn)在pH 12條件下,最大VFAs濃度為2 930 mg/L;在pH 10條件下,VFAs最大濃度為6 128 mg/L;在pH 8條件下,VFAs最大濃度為5 463 mg/L。堿性環(huán)境下的VFAs濃度均高于未調(diào)節(jié)pH的VFAs濃度。Cheah等[16]利用城市垃圾發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí),在酸性條件 (pH 6) 下發(fā)酵3.5 d后,VFAs濃度是最初體系中濃度的2倍。同樣是利用城市垃圾產(chǎn)酸,Moretto等[17]在實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測發(fā)酵體系的pH變化,發(fā)現(xiàn)pH隨發(fā)酵時(shí)間降低,尤其在初始條件為堿性時(shí)變化顯著,在低于pH 4.5時(shí)水解過程及產(chǎn)酸菌生長嚴(yán)重受到抑制,最終導(dǎo)致有機(jī)物溶解及VFA積累下降。另外,pH還會(huì)影響VFAs的類型,Cokgor等[18]的研究顯示在pH 5.5時(shí)乙酸產(chǎn)生的百分比約為70%,而在pH 6.5時(shí)乙酸所占比例降低為35%左右。因此,在生產(chǎn)特定類型的VFAs組成時(shí),需要確定最佳pH。

    2.3 有機(jī)負(fù)荷率對(duì)水解酸化的影響

    有機(jī)負(fù)荷率 (OLR) 可以反映體系中微生物處理有機(jī)物的能力,在水解酸化的過程中有機(jī)物被微生物分解成VFAs。Lim等[19]發(fā)現(xiàn)食品垃圾中隨著OLR從5 g/(L·d)增加到13 g/(L·d),厭氧產(chǎn)生的VFAs濃度從 (13.0–14.0) g/L增加到(28.9–30.0) g/L;而當(dāng)OLR超過13 g/(L·d)時(shí),反應(yīng)器變得不穩(wěn)定。此外,增加OLR會(huì)改變VFA的組分。Tang等[20]研究了食品垃圾乳酸發(fā)酵的結(jié)果,當(dāng)OLR從14 g/(L·d)增加到22 g/(L·d)時(shí),乙酸濃度從2.1 g/L增加到5.5 g/L,丙酸和丁酸則幾乎沒有變化;當(dāng)OLR從14 g/(L·d)增加到18 g/(L·d)時(shí),乳酸濃度從29 g/L上升至37.6 g/L;OLR從18 g/(L·d)增加到 22 g/(L·d)時(shí),乳酸產(chǎn)量急劇下降至22 g/L。Wijekoon等[21]在厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵工藝中,將OLR從5 g/(L·d)提高到12 g/(L·d)時(shí)發(fā)現(xiàn)VFA的主要組分從乙酸變成正丁酸。因此,優(yōu)化OLR參數(shù)不僅可以提高酸的產(chǎn)量還可以獲取不同種類的VFA。

    2.4 停留時(shí)間對(duì)污泥水解酸化的影響

    停留時(shí)間包括固體停留時(shí)間 (SRT) 與水力停留時(shí)間 (HRT),使用剩余污泥來生產(chǎn)VFAs時(shí),SRT等于HRT[22]。Feng等[23]在pH 10條件下,SRT從4 d延長至12 d,VFAs濃度增加了43.6%;而SRT增加至16 d時(shí),VFAs濃度下降,可能是由于產(chǎn)甲烷菌消耗了部分生成的VFAs。所以在一定的范圍內(nèi)增加SRT可以提高VFAs的產(chǎn)量。SRT對(duì)于VFAs組分中乙酸和丙酸的影響較大,SRT從4 d增加到16 d,乙酸的比例從32.0%增加到42.4%,而丙酸則從23.6%下降到14.3%,丁酸與戊酸保持相對(duì)穩(wěn)定。Yuan等[24]的研究中,隨著SRT延長至10 d,VFAs產(chǎn)量增加了46%,但是乙酸所占比例從第5天的66%下降至第10天的49%,丙酸的比例保持穩(wěn)定,維持在17%左右。適當(dāng)調(diào)整停留時(shí)間,提高水解酸化過程中VFAs的產(chǎn)量,可以為菌群富集和PHA合成階段積累充足的養(yǎng)分。

    3 污泥菌群的富集馴化及PHA合成

    3.1 污泥菌群的富集馴化模式

    菌群富集馴化的目的是為了富集PHA合成菌,以獲得較高的PHA產(chǎn)量?;钚晕勰嗪铣蒔HA的工藝中,較多采用好氧瞬時(shí)補(bǔ)料工藝 (豐盈-饑餓模式)。該工藝使微生物在豐盈和饑餓狀態(tài)下反復(fù)交替。在豐盈狀態(tài)下,菌群可以將過量碳源轉(zhuǎn)化成PHA儲(chǔ)存在體內(nèi);而在饑餓狀態(tài)時(shí),這些物質(zhì)可以被利用供微生物的生長和代謝。通過這種選擇性壓力,每個(gè)周期都會(huì)淘汰掉部分無法合成PHA的菌株,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PHA合成菌群的富集。清華大學(xué)王慧教授課題組采用該模式馴化活性污泥,得到具有較高PHA合成能力的菌群S-150,并通過將剩余污泥的厭氧發(fā)酵控制在水解酸化階段大量合成VFAs。然后以S-150為菌種分別利用剩余污泥水解酸化液及模擬污泥水解液合成PHA,PHA含量最高可達(dá)細(xì)胞干重的62.43%[25]。除此之外,活性污泥菌群的馴化還可采用厭氧-好氧工藝,該過程中微生物在厭氧階段處于休眠期,主要是微生物對(duì)碳源進(jìn)行攝取在體內(nèi)儲(chǔ)存PHA,隨后的好氧階段通入空氣時(shí),此時(shí)體系碳源不足以供菌群生長代謝,而PHA合成菌可以利用儲(chǔ)存的PHA繼續(xù)生長。Liu等[26]報(bào)道使用該工藝不僅可以對(duì)廢水進(jìn)行生物除磷,對(duì)PHA合成菌群的富集也具有一定效果,實(shí)現(xiàn)了污水處理和合成PHA的雙重效果。Bengtsson等[27]利用該模式處理廢水時(shí),通過菌群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)了大量的聚磷菌 (PAOs) 和聚糖菌 (GAOs),這兩種菌群是典型的PHA合成優(yōu)勢菌群。除此之外還可以將不同的合成工藝整合來富集PHA合成菌群,比如將利用微生物產(chǎn)H2和PHA合成相結(jié)合。Suriyamongkol等[28]研究發(fā)現(xiàn)H2可以作為合成VFAs的中間體,而VFAs可以被微生物利用產(chǎn)PHA,將兩個(gè)工藝相結(jié)合不僅可以獲取H2能源,而且有利于富集PHA合成菌群。

    3.2 影響菌群富集的因素

    在菌群富集的過程中,基質(zhì)、pH、溫度、SRT等條件參數(shù)都會(huì)影響最終的富集效果和微生物群落結(jié)構(gòu)。Janarthanan等[29]提出不同基質(zhì)投放會(huì)影響污泥中PHA菌群的馴化效果。Beccari等[30]在研究中發(fā)現(xiàn)在富集PHA合成菌群時(shí),當(dāng)使用復(fù)雜的富含VFAs的原料時(shí),如橄欖油廢水,更有利于PHA菌群的富集。Oliveira等[31]通過研究發(fā)現(xiàn),在低有機(jī)負(fù)荷體系中,通過添加奶酪乳清促進(jìn)PHA菌群的富集。除此之外在富集階段,優(yōu)先考慮改善PHA合成菌群的生長條件,投加之前需對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理。Korkakaki等[32]對(duì)城市垃圾過濾液稀釋后再進(jìn)行投放,較未處理組的富集效果顯著提升。另外還可以通過控制溫度與pH的方法為混合菌群創(chuàng)造良好的生長環(huán)境。Zhang等[33]在以有毒污染物苯酚為原料合成PHA的過程中,考察了不同溫度對(duì)微生物富集的影響,發(fā)現(xiàn)低溫可以抑制PHA合成菌群的生長,菌群的豐富度也降低。在此之前的研究中表明在pH<7時(shí),菌群生長變緩,F(xiàn)leit等[34]發(fā)現(xiàn)這種抑制作用可能與低pH下底物中的未解離酸 (如乙酸) 有關(guān)。這些酸可以擴(kuò)散到細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)造成質(zhì)子負(fù)荷,從而導(dǎo)致菌體代謝生長變慢。Oehmen等[35]研究pH對(duì)富集階段菌群結(jié)構(gòu)的影響時(shí),通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)富集體系控制在pH為8時(shí),富集菌群的生物量是未控制pH體系的兩倍,最終前者體系中PHA的積累率也明顯提升??刂芐RT對(duì)活性污泥合成PHA的體系至關(guān)重要,SRT參數(shù)作為一種選擇性壓力可以表征富集過程中微生物世代交替時(shí)間,適當(dāng)調(diào)控SRT可以保持富集體系中微生物的活性[36]。Albuquerque等[37]利用水解酸化后的廢水對(duì)PHA合成菌群進(jìn)行富集,通過調(diào)整不同的SRT進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn),最終發(fā)現(xiàn)在SRT設(shè)為10 d時(shí),富集效果最佳,菌群代謝旺盛,PHA的合成比例高達(dá)74.6%。

    3.3 影響PHA積累的因素

    富集之后的PHA合成菌群具有相似的代謝特征,根據(jù)生長環(huán)境的變化,菌群會(huì)利用碳源合成PHA[38]。雖然具備這種特征,在PHA積累過程中還應(yīng)該控制微生物的生長環(huán)境,如通過控制補(bǔ)料模式、溶解氧、碳源種類、氮磷比、pH、溫度等參數(shù),來滿足微生物合成代謝的需求。目前報(bào)道的補(bǔ)料方式主要有兩種:間歇批次補(bǔ)料模式和連續(xù)補(bǔ)料模式。在PHA生產(chǎn)中間歇批次補(bǔ)料模式應(yīng)用最廣泛。Serafim等[39]采用間歇批次補(bǔ)料模式,將乙酸分3次加入反應(yīng)器,最后合成的PHA含量高達(dá)78.5%。與間歇批次補(bǔ)料模式相比,連續(xù)補(bǔ)料不會(huì)中斷反應(yīng),可以防止微生物在中斷過程中消耗體內(nèi)儲(chǔ)存的PHA,但是該過程對(duì)碳源的利用率較低。Albuquerque等[40]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,同等條件下在連續(xù)補(bǔ)料模式中微生物對(duì)碳源的攝取速率和代謝活力比間歇批次補(bǔ)料更具有優(yōu)勢,最終PHA的產(chǎn)量高出5%。

    氧氣供給是混合菌群利用活性污泥合成PHA的關(guān)鍵因素。Wang等[41]通過改變氧氣的供應(yīng)證明PHA的合成與硝化反應(yīng)密切相關(guān),通過調(diào)節(jié)溶解氧 (DO),不僅可以促進(jìn)氮的去除,而且不影響現(xiàn)有菌群的PHA最大存儲(chǔ)速率,為活性污泥生產(chǎn)PHA工藝生產(chǎn)條件的控制提供了依據(jù)。鄭裕東 等[42]在厭氧-好氧模式下研究PHA合成時(shí),發(fā)現(xiàn)污泥中大多數(shù)微生物利用碳源合成聚磷酯和糖原等物質(zhì),PHA實(shí)際占的比重較低,而對(duì)通氧量進(jìn)行控制可以促進(jìn)微生物積累PHA。

    合成PHA的種類與所使用的底物的組成直接相關(guān),脂肪酸、葡萄糖、蔗糖和果糖通過代謝產(chǎn)生不同的羥基烷酸單體,并用于PHA的生物合成。選擇不同碳源,菌群積累PHA的能力也有所不同。哈爾濱工業(yè)大學(xué)陳志強(qiáng)等[43]以VFAs作為碳源,開發(fā)了一種利用污泥菌群合成PHA的連續(xù)供料模式,PHA最高積累量可達(dá)菌體干重的70.4%。廈門大學(xué)王遠(yuǎn)鵬等[44]選用乙酸 (和丙酸)為碳源,利用二沉池活性污泥在序批式反應(yīng)器中發(fā)酵合成PHBV,積累率可達(dá)到74%。Rodriguez等[45]對(duì)近些年利用不同廢棄物合成PHA報(bào)道作了統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)混合菌群利用的廢棄底物來源廣泛,并且合成PHAs的種類豐富,具有巨大的應(yīng)用潛力。Palmeiro等[46]報(bào)道在中試規(guī)模下活性污泥中PHA的含量占污泥有機(jī)質(zhì)成分的66%,活性污泥不僅可以作為菌種來源,同時(shí)也可以作為合成底物,富含可供微生物生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì),目前報(bào)道利用活性污泥合成PHA的產(chǎn)率接近純菌發(fā)酵的產(chǎn)率。Ribeiro等[47]在利用粗甘油合成PHA的過程中,發(fā)現(xiàn)底物基質(zhì)里中鏈和長鏈的脂肪酸比例越高,合成的中鏈和長鏈聚合物的摩爾含量越大。

    在PHA合成階段,適當(dāng)控制pH可以促進(jìn)微生物的代謝積累。Villano等[48]在研究控制pH對(duì)PHA積累影響時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH 7.5–9.0時(shí)更有利于PHA積累,并且通過pH改變可以控制PHAs的合成種類。相反如果不控制pH,甚至?xí)?dǎo)致PHA的水解,Zheng等[49]研究發(fā)現(xiàn)在厭氧堿性 (pH 10) 發(fā)酵條件下,通過熒光原位雜交 (FISH)等技術(shù)研究菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)有大量的假單胞菌屬和產(chǎn)堿桿菌屬富集,這兩種菌可以分泌胞外蛋白酶和解聚酶,將PHA水解成單體 (3-羥基丁酸、3-羥基戊酸),之后產(chǎn)酸菌可以利用這些單體合成短鏈脂肪酸。不同基質(zhì)中N/P含量有所差異,研究表明高濃度的氮磷會(huì)影響微生物的代謝生長,Korkakaki等[32]通過曝氣使垃圾滲濾液中的磷酸鹽沉淀,低濃度的磷酸鹽不會(huì)造成微生物的生長抑制,提高了PHA積累率。Schmidt等[50]研究發(fā)現(xiàn)氮的消耗會(huì)導(dǎo)致PHB產(chǎn)量下降,而3-羥基戊酸酯的積累和氮的消耗保持在同一水平,因此在生產(chǎn)體系中要補(bǔ)充氮元素以獲得較高的PHA產(chǎn)率。

    4 PHA的生物合成機(jī)制

    雖然混合培養(yǎng)合成PHA的研究已經(jīng)取得令人矚目的成果,但是與單一菌種發(fā)酵相比還有不小差距。有效縮短馴化富集時(shí)間,提高PHA在污泥中的含量成為擺在污泥資源化利用面前的難題,而深入的PHA合成機(jī)制研究有助于解決這一問題。

    4.1 PHA代謝相關(guān)基因

    已知的PHA代謝相關(guān)的酶和調(diào)控蛋白及它們的編碼基因見表1,按照所執(zhí)行的功能,可分別歸類為PHA合成、PHA降解和PHA代謝調(diào)控[51-52]。

    其中PHA合酶 (PHA synthase,PhaC) 是PHA生物合成過程中最關(guān)鍵的酶,由(或)編碼。它能夠以羥基脂肪酸 (HA) 的CoA硫酯為底物,催化HA脫去CoA聚合形成PHA。根據(jù)合成PHA的類型、合酶結(jié)構(gòu)中亞基的種類以及對(duì)底物的特異性,PHA合酶可分為4種類型 (Ⅰ?Ⅳ合酶)。Ⅰ類和Ⅱ類合酶由一個(gè)亞基組成 (PhaC),其分子量大約為60 kDa,Ⅲ類合酶由PhaC亞基 (分子量40–53 kDa) 和PhaE亞基 (分子量20–40 kDa)組成,Ⅳ類合酶由PhaC亞基 (分子量約41 kDa)和PhaR亞基 (分子量約22 kDa) 組成。四類PHA合酶都可以行使催化功能,盡管組分及結(jié)構(gòu)具有一定差異,但均以二聚體形式進(jìn)行催化。Ⅰ類和Ⅱ類合酶以兩個(gè)PhaC亞基形成同二聚體,而Ⅲ類和Ⅳ類合酶分別由兩個(gè)不同亞基形成異二聚體進(jìn)行催化。在合成過程中,Ⅰ類、Ⅲ類和Ⅳ類PHA合酶可以利用丙酸鹽、丁酸鹽、戊酸鹽、己酸鹽等合成短鏈聚合物 (scl-PHA),而Ⅱ型PHA合酶可以利用烷烴等作為前體合成中鏈聚合物 (mcl-PHA)。此外,丙二酰輔酶A?;D(zhuǎn)移蛋白轉(zhuǎn)酰酶(由編碼) 及3-酮酰輔酶A還原酶(由fabG編碼) 等與PHA合成途徑相耦聯(lián)的酶也參與了PHA合成。

    PHA憑借生物可降解特性受到了科學(xué)界廣泛關(guān)注,在降解的過程中PHA解聚酶 (Depolymerase,PhaZ) 起到了關(guān)鍵作用,它可以將PHA分解成小分子量的寡聚體[53]。PhaZ酶位于PHA顆粒上,它可以水解含有脂肪族和芳香族單體的PHA,該酶由一條多肽鏈構(gòu)成 (分子量37–60 kDa),包括N-端催化結(jié)構(gòu)域、C-端催化結(jié)構(gòu)域和兩位點(diǎn)的結(jié)合區(qū)[54]。Jendrossek等[55]研究發(fā)現(xiàn)微生物可以通過在胞外或者胞內(nèi)分泌解聚酶來降解不同環(huán)境中的PHA,然后利用分解后的小分子物質(zhì)作為碳源供細(xì)胞生長繁殖。在PHA降解的過程中,解聚酶的催化效率取決于環(huán)境因素以及PHA的種類。Huisman等[56]研究發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下微生物對(duì)PHA的降解時(shí)間可長達(dá)數(shù)月,而在高鹽的海水中則需要一年。Kunioka等[57]在研究PHA的單體構(gòu)造時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)引入4HB單體時(shí),PHA的降解速度顯著提高,最終的降解對(duì)比結(jié)果是P (3HB-co- 4HB)>P (3HB)>P (3HB-co-3HV)。

    表1 PHA代謝相關(guān)的酶和蛋白及其編碼基因

    PHA是以包涵體的形式儲(chǔ)存在微生物體內(nèi),其表面覆蓋蛋白質(zhì)層,這些蛋白質(zhì)被稱為PHA顆粒結(jié)合蛋白 (GAPs),在PHA代謝中起調(diào)控作用,其中phasin蛋白占絕大多數(shù)。Phasin蛋白是不均勻的小尺寸蛋白質(zhì)群,具有兩親性 (可保護(hù)疏水性聚合物),它雖然缺乏一定的催化功能,但是在PHA顆粒構(gòu)造和代謝過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用[58]。近些年,大量phasin蛋白被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了其功能??茖W(xué)家在青枯菌中發(fā)現(xiàn)了大量的PhaP家族蛋白,這些多肽與PHA的疏水端緊密結(jié)合,可以分散PHA顆粒,防止與其他蛋白質(zhì)特異性結(jié)合[59]。Kuchta等[60]通過構(gòu)建突變菌株發(fā)現(xiàn)PhaP基因缺失雖然不會(huì)對(duì)PHA合成產(chǎn)生影響,但是會(huì)顯著影響PHA的成粒,最終突變菌株體內(nèi)會(huì)形成一個(gè)大顆粒的PHA。Prieto等[61]在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)了PhaF蛋白,證實(shí)了該蛋白有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域:N-末端和C-末端,其中N-末端與PHA結(jié)合,而C-末端則非特異性與DNA結(jié)合。PhaF蛋白不僅可以增強(qiáng)PHA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性,而且對(duì)PHA在細(xì)胞內(nèi)的定位起關(guān)鍵作用,它可以將DNA與PHA顆粒連接,確保兩者在細(xì)胞分裂時(shí)分配均勻[62]。

    4.2 微生物中PHA的合成途徑

    微生物中已知的PHA合成途徑主要分為3種:1) 聚羥基丁酸 (Polyhydroxybutyrate,簡稱PHB)的葡萄糖合成途徑;2) 脂肪酸β-氧化途徑;3) 脂肪酸從頭合成途徑[63]。微生物以VFAs 為碳源合成PHA時(shí),以H16合成聚羥基丁酸戊酸共聚酯 (Poly (3-hydroxybutyrate-co-3- hydroxyvalerate),簡稱PHBV) 為例,主要的合成途徑包括:1) 乙酸主要經(jīng)乙酰輔酶A合成酶 (由編碼) 或乙酸激酶 (由編碼) 催化生成乙酰輔酶A,β-酮基硫解酶 (由編碼) 催化2個(gè)乙酰輔酶A縮合成乙酰乙酰CoA,乙酰乙酰CoA由NADPH依賴的乙酰乙酰CoA還原酶 (由編碼) 還原生成3HBCoA,然后在PhaC的催化下參與合成PHA;2) 丙酸經(jīng)丙酰輔酶A合成酶 (由編碼) 催化生成丙酰輔酶A,β-酮基硫解酶 (由編碼) 再催化1分子的乙酰CoA和1分子丙酰CoA縮合而成的β-酮戊酰CoA,β-酮戊酰CoA在PhaB的催化下生成3-羥基戊酰CoA,然后在PhaC的催化下參與合成PHA;3) 丁酸經(jīng)β-氧化過程的酶催化生成丁烯酰CoA,再經(jīng)(R)-烯脂酰CoA水合酶 (由編碼) 催化生成(R)-3-羥基丁酰CoA用于PHA的合成。此外,(R)-3-羥基脂酰-ACP:CoA?;D(zhuǎn)移酶 (由編碼) 催化脂肪酸從頭合成途徑的中間產(chǎn)物 (R)-3-羥基脂酰-?;d體蛋白轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的CoA的衍生物,用于PHA的合成。合成的PHA可以被解聚酶 (由編碼) 作用后,被微生物重新利用?;钚晕勰嗑褐锌赡艿腣FAs消耗及PHA代謝途徑見圖1。

    圖1 活性污泥菌群中可能的VFAs消耗及PHA代謝途徑

    4.3 混合培養(yǎng)PHA合成菌群研究

    變性梯度凝膠電泳 (DGGE)、末端限制性片段長度多態(tài)性分析 (T-RFLP) 等技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于分析混合培養(yǎng)PHA合成菌群的結(jié)構(gòu)[64-65]。隨著價(jià)格的大幅度降低,高通量測序逐漸成為目前菌群研究的主要技術(shù)手段。Wang等[66]利用16S rDNA高通量測序,分析了強(qiáng)化生物除磷工藝中污泥菌群結(jié)構(gòu),并利用宏基因組高通量測序從中拼接出一株名為GAO-HK菌株的接近完整的基因組草圖,并挖掘出菌株降解嗎啉過程中通過乙醛酸循環(huán)利用VFAs合成PHA的代謝途徑。Oshiki等[67]通過對(duì)多種活性污泥的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,發(fā)現(xiàn)具有合成PHA潛力的微生物在污泥菌群所占比例為11%–18%。

    Wang等[68]以處理[Cl–]高達(dá)24 000 mg/L以上的環(huán)氧丙烷 (Propylene epoxide,簡稱 PO) 皂化廢水的活性污泥菌群為研究對(duì)象,采用豐盛-饑餓模式向PO皂化廢水中定期添加乙酸,馴化PO皂化廢水活性污泥菌群合成PHA,最終獲得占污泥干重23.67%的PHBV,同時(shí)污泥馴化及合成PHA過程中COD明顯降低,證明PO皂化廢水污泥菌群經(jīng)馴化可利用含VFAs廢水合成PHA。利用 16S rDNA高通量測序,檢測了馴化前后污泥菌群的變化情況,推測芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌、短波單胞菌及假單胞菌等為污泥中可能合成PHA的微生物。

    越來越多的優(yōu)勢菌株被篩選和鑒定,在基因水平上證明了活性污泥來源的微生物具有較強(qiáng)的PHA合成潛力。Janarthanan等[29]通過對(duì)污泥樣品中的菌群進(jìn)行基因測序,分析了PHA合成菌群的多樣性和豐富度以及MMCs (Mixed microbial cultures,微生物混合培養(yǎng)) 的動(dòng)態(tài)變化,評(píng)估出該條件中PHA合成的潛力。因此利用高通量測序技術(shù)研究污泥中PHA菌群的結(jié)構(gòu)能夠更好地使PHA生產(chǎn)工藝和廢水的處理相結(jié)合。

    5 展望

    隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展,未來有關(guān)混合培養(yǎng)合成PHA研究領(lǐng)域的重點(diǎn)方向?qū)⑹菑纳锒鄻有猿霭l(fā)深入研究合成PHA菌群的特征及相關(guān)代謝途徑等[52]。另外,借鑒陳國強(qiáng)等開發(fā)的藍(lán)水生物技術(shù)的研究經(jīng)驗(yàn)[69],從馴化富集的污泥中篩選PHA合成優(yōu)勢菌株,并在開放條件下利用污泥水解酸化產(chǎn)生的VFAs為碳源合成PHA,也可能會(huì)成為混合培養(yǎng)合成PHA研究的一個(gè)主要方向。

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    Advances in synthesis of polyhydroxyalkanoates by using residual activated sludge

    Dong Meng, Ruirui Li, Yuling Liu, Xiangyu Fan, Zhaosong Huang, Pengfei Gu, and Qiang Li

    ,’,’250022,,

    Pure microbial fermentation is the primary means of polyhydroxyalkanoates (PHA) production at present, but high cost limits its large-scale application. In recent years, the synthesis of PHA by mixed microbial culture of activated sludge has been extensively studied. Combining the residual sludge treatment with PHA synthesis not only eliminates the sterilization process necessary for pure culture, but also utilizes residual sludge as resource. The hydrolysis and acidification of the residual sludge, the enrichment and acclimation of the consortium and the PHA synthesis are affected by environmental factors. The intensive biosynthesis mechanism study is helpful for the application of mixed culture to synthesize PHA. This paper introduces the feasibility of using residual sludge to synthesize PHA, the factors affecting the hydrolysis and acidification of residual sludge, the accumulation and domestication of PHA by sludge microbial consortium and its mechanism.

    polyhydroxyalkanoates, activated sludge, volatile fatty acids, mixed microbial culture

    July9, 2019;

    August 26, 2019

    National Natural Science Foundation of China (Nos.31870105, 31741007).

    Qiang Li. Tel: +86-531-82767364; Fax: +86-531-89736818; E-mail: chm_liq@ujn.edu.cn

    國家自然科學(xué)基金 (Nos.31870105, 31741007) 資助。

    2019-09-09

    http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190906.1035.001.html

    孟棟, 李枘枘, 劉玉玲, 等. 利用剩余活性污泥合成聚羥基脂肪酸酯的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(11): 2165–2176.

    Meng D, Li RR, Liu YL, et al. Advances in synthesis of polyhydroxyalkanoates by using residual activated sludge. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2165–2176.

    (本文責(zé)編 郝麗芳)

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