龍牙百合粉多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化

□ 鄧 鵬 廖 聰 何 平 尹樂斌 邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院

龍牙百合是百合科百合屬中的優(yōu)質(zhì)種類，其鱗片肥厚且適度彎曲，鱗片顏色為潔白到寶黃之間，型似龍牙，故稱龍牙百合。龍牙百合鱗片營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量淀粉以及豐富的糖類、生物堿和多酚類物質(zhì)，具有潤(rùn)肺止咳、寧心安神之效。研究表明，多糖類物質(zhì)具有降血脂、降血糖和抗氧化之效[1-2]。近年來，龍牙百合產(chǎn)量逐漸上升，關(guān)于龍牙百合綜合利用的研究也越來越重要，因此本文對(duì)龍牙百合粉多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其ABTS自由基、DPPH自由基清除能力進(jìn)行研究。

1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)儀器主要為VELOCITY-14R離心 機(jī)（Dynamica-Scientific-Lid）；UV-1780紫外分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；EL204分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SY-1220恒溫水浴槽（南京市暢翔儀器設(shè)備有限公司）。

實(shí)驗(yàn)材料有龍牙百合粉（邵陽市隆回縣提供）；苯酚（成都金山生化試劑有限公司）；濃硫酸：（寧波市星月化玻有限公司）；蒽酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，溶解稀釋后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容。2 mg/mL蒽酮溶液配置：準(zhǔn)確稱取200 mg蒽酮，溶解于100 mL的濃硫酸之中，轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中，低溫貯藏（現(xiàn)配現(xiàn)用）。取6支潔凈的具塞刻度試管，分別移取0、0.1、0.2、0.3、0.4 mL與0.5 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)充蒸餾水至1 mL，置于冰水浴中，加入2 mg/mL蒽酮溶液4 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫，于620 nm測(cè)試吸光度。

2.2 龍牙百合多糖提取方法及提取率計(jì)算

取龍牙百合粉2 g，按單因素實(shí)驗(yàn)條件提取，提取結(jié)束后于4 ℃下，6 000 r/min離心15 min，取0.1 mL離心液加入到100 mL容量瓶中，得龍牙百合多糖提取液，重復(fù)3次。

多糖提取率計(jì)算如公式（1）。

式（1）中：A為多糖提取率；c為提取液多糖濃度（mg/mL）；V為溶液體積（mL）；m為原料質(zhì)量（mg）。

2.3 單因素工藝優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)主要從不同料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)方面進(jìn)行龍牙百合提取多糖的工藝參數(shù)優(yōu)化。

2.3.1 不同料液比對(duì)多糖提取的影響

稱取龍牙百合粉2 g，將蒸餾水按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40與1∶50（g/mL）的比例，加入錐形瓶中，搖勻并放入70 ℃水浴鍋中，提取1.5 h，提取3次。

2.3.2 提取溫度對(duì)多糖提取的影響

稱取龍牙百合粉2g，將蒸餾水按料液比1∶30加入錐形瓶中，搖勻并放入50、60、70、80 ℃和90 ℃下的水浴鍋中，提取1.5 h，提取3次。

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

稱取龍牙百合粉2 g，將蒸餾水按料液比1∶30加入錐形瓶中，搖勻并放入70 ℃的水浴鍋中，提取0.5、1.0、1.5、2.0 h以及2.5 h，提取3次。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間、提取溫度和不同料液比為變量作為影響因素，多糖提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交優(yōu)化。

2.5 抗氧化性指標(biāo)測(cè)定

為研究龍牙百合總酚的抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)龍牙百合總酚清除ABTS自由基、DPPH自由基的能力進(jìn)行研究[3-4]。

2.5.1 ABTS自由基清除率測(cè)定

ABTS儲(chǔ)備液的配制：將20 mL的7 mmol/L的 ABTS和 352 μL的 140 nmol/L的過硫酸鉀混和，于暗處室溫下放置12～16h。使用前用無水乙醇稀釋成ABTS工作液，并將工作液的溫度控制在30 ℃，734 nm波長(zhǎng)下的吸光度為（0.7±0.02）。取提取液0.5 mL和1.5 mL無水乙醇加入試管中，以2 mL的無水乙醇作空白對(duì)照，加ABTS工作液2 mL靜置6 min后，在波長(zhǎng)734 nm下測(cè)其吸光度，最后按公式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率。

式（2）中：M1表示ABTS自由基清除率；Ni為提取液吸光值；Nj是對(duì)照組的吸光值。

2.5.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

將 2 mL的 2.0×10－4mol/L的DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）乙醇溶液和2 mL提取液混合，室溫下避光靜置30 min，以乙醇為對(duì)照組，并于517 nm處檢測(cè)吸光度，DPPH自由基清除率由公式（3）計(jì)算。

式（3）中：M2表示DPPH自由基清除率；Nm是提取液的吸光值；Nc是對(duì)照組的吸光值；Nk本底吸光值。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由Excel擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，曲線方程為y=8.104 3x+0.009 6。其中R2=0.998 3，表示該回歸曲線可靠。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 料液比對(duì)多糖提取率的影響圖

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響圖

圖4 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響圖

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 不同料液比對(duì)多糖提取的影響

由圖2可得，多糖提取率先上升后下降，這是因?yàn)榱弦罕冗^低時(shí)，百合粉不能充分與溶劑接觸，接觸面積過低，導(dǎo)致多糖溶出量較少。隨著料液比的增大，百合粉逐漸充分溶解于溶劑之中，多糖提取量也因此增大，直到1∶40達(dá)到極值。隨著料液比的繼續(xù)增大，多糖因分散更容易被分解，以至于料液比1∶50時(shí)，提取率開始下降。

3.2.2 提取溫度對(duì)多糖提取的影響

提取溫度對(duì)多糖提取的影響如圖3所示，從圖3可得，隨著溫度的上升，提取率先升后降，這可能是因?yàn)闇囟冗^低，水分子不夠活躍，導(dǎo)致多糖溶出較低。隨著溫度的上升，分子運(yùn)動(dòng)激烈，從而使得多糖溶出增加，80 ℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高值。同時(shí)隨著溫度的上升，多糖的分解速率也在上升，在90 ℃提取，溶出速率與分解速率差值隨著提取時(shí)間越來越小，直到1.5 h時(shí)，分解速度已經(jīng)大于溶出速率，所以提取率低于80 ℃。

3.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取的影響

如圖4所示，提取時(shí)間處于0.5～1.5 h時(shí)，提取率呈先上升趨勢(shì)，于1.5 h達(dá)到峰值，隨后開始下降。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過短，多糖尚未完全溶出，以至于提取不完全，隨著提取時(shí)間的增加，胞內(nèi)與胞外多糖濃度漸漸平衡，溶出速率降低，但隨著胞外多糖濃度的上升，其分解速率也在上升，在1.5 h之后分解速率占上風(fēng)，因此多糖提取率呈下降趨勢(shì)，所以最佳提取時(shí)間為1.5 h。

3.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化龍牙百合總酚提取結(jié)果

3.3.1 正交實(shí)驗(yàn)水平

由單因素結(jié)果可得最佳液料比為1∶40、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間為1.5 h，因此設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)水平如表1所示。

3.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

龍牙百合多糖提取工藝優(yōu)化，以提取時(shí)間、提取溫度、液料比為因素變量，總酚提取量為衡量指標(biāo)的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，方案及結(jié)果見表2所示。由表2得出，3個(gè)因素對(duì)龍牙百合多糖的提取率的影響為：料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。龍牙百合提取總酚的最佳工藝條件組合為A1B2C2，即提取時(shí)間為1.5 h、提取溫度為80 ℃、料液比為1∶40。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)分析表

3.4 正交實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證結(jié)果

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多糖平均提取得率6.52%（n=3）。

3.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

在提取龍牙百合多糖的最佳工藝條件下測(cè)定ABTS自由基和DPPH自由基的清除率，結(jié)果分別為67.2%與62.4%。

4 結(jié)論

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)多糖提取率結(jié)果的影響程度排序?yàn)榱弦罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間，在時(shí)間為1.5 h、溫度為80 ℃、料液比為1∶40時(shí)，提取結(jié)果最佳。此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，多糖提取率為6.52%（n=3），具有真實(shí)性及較好的穩(wěn)定性，其ABTS自由基清除率為67.2%，DPPH自由基的清除率為62.4%。優(yōu)化所得的水提工藝穩(wěn)定、可行，可用于龍牙百合粉的多糖的提取。