中藥保健品中非法添加磷酸二酯酶-5抑制劑檢測方法的研究進展

丁德英，劉 偉，呂狄亞

(海軍軍醫(yī)大學藥學院，上海，200433)

1 磷酸二酯酶5型抑制劑

磷酸二酯酶5型(PDE-5)抑制劑臨床用于不同病因引起的男性勃起功能障礙(erectile dysfunction,ED)，而經(jīng)美國食品和藥品管理局(FDA)批準[1-2]的只有枸櫞酸西地那非(Viagra?,Pfizer)、伐地那非(Levitra?,Bayer)、他達那非(Cialis?,Lilly)。服用PDE-5抑制劑易引起的副作用如頭痛、面部潮紅，鼻充血，視力障礙和背部疼痛，還會引起潛在的藥物之間的相互作用。若患者在不知情的情況下，與硝酸酯或α-受體阻滯劑一同服用會導致低血壓甚至暈厥。因此，此類藥物必須在醫(yī)生指導下使用。

在許多國家，由于對 PDE-5 抑制劑的需求廣泛，一些非法添加的性功能保健產(chǎn)品在市場上所占比例也與日俱增[2-5]。在歐洲，每年有160萬的非法性功能保健品在銷售。其中大多都是中藥膳食補充劑和保健品[1]。而這類保健品被人們認為是“安全、純天然”，而且比起處方藥更易獲得，在因特網(wǎng)上就可以直接以低廉的價格直接購得。迄今為止，我國衛(wèi)生部核準的保健食品的27項功效中，沒有改善或提高性功能這一項，也尚未批準過一種合法的壯陽保健品，中醫(yī)專家也并不認同“中藥偉哥”的說法。這些所謂的“純天然”中藥保健品真正起到藥效的并非中藥材本身，而是不法商人在其中非法添加了 PDE-5 抑制劑。

最早的文獻報道是在食品飲料中檢出并鑒別為非法添加的西地那非衍生物豪莫西地那非[6]。接著，Blok-Tip等[7]在中藥產(chǎn)品中檢測出3種西地那非衍生物，分別為豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非和紅地那非。在近期文獻報道中，中藥保健品中非法添加的PDE-5抑制劑或其衍生物至少有46種[5]。2008年國家食品藥品監(jiān)督管理局(China Food and Drug Administration,CFDA)頒布“補腎壯陽類中成藥中西地那非及其類似物的檢測方法”，可以對違法添加的西地那非、他達那非、紅地那非、伐地那非進行篩查檢測。有效的分析方法和策略對于非法添加其衍生物[1,8-9]的檢測就顯得至關(guān)重要。因此，筆者綜述了西地那非、伐地那非、他達那非衍生物的種類以及中藥保健品中添加這3類衍生物的檢測方法，以期為更多衍生物的結(jié)構(gòu)的確證和鑒定提供依據(jù)。

目前，用于分離和鑒定西地那非衍生物或混合物的分析方法有紅外光譜法(IR)、近紅外光譜法(NIR)、核磁共振法(NMR)、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、質(zhì)譜法(MS)等。

2 鑒定方法

2.1 紅外光譜 (infrared spectrum，IR)

紅外光譜技術(shù)具有高效、快速、無損傷檢測的特點，是通過測定被測物質(zhì)在紅外光譜區(qū)的特征光譜，利用適宜的化學計量學方法提取相關(guān)信息后，對被測物質(zhì)進行定性、定量分析的一種分析技術(shù)。如Champagne采用傅里葉變換紅外光譜分析技術(shù)(FTIR)，ATR采樣系統(tǒng)，對純樣品與摻假原料的紅外光譜比較分析，發(fā)現(xiàn)含有PDE-5抑制劑的樣品在1 720～1 150 cm-1處有明顯變化[10]。也有利用近紅外光譜(NIR)方法，根據(jù)枸櫞酸西地那非6 200～5 700 cm-1特征譜，在103種不同外觀、化學成分和來源的西地那非樣品中，可以準確的預測出98%的樣品中是否存在枸櫞酸西地那非[11]。近紅外光譜圖復雜，通常需要建立一個可靠的藥物篩選程序，包括了一個專用的常用藥物的近紅外光譜數(shù)據(jù)庫后，來檢測一些摻雜西地那非衍生物的保健品和藥品[12]。

紅外光譜的劣勢在于需要提前對大量藥品進行掃描確證，并構(gòu)建紅外光譜數(shù)據(jù)庫，工作繁瑣。加上中藥體系成分復雜，摻雜組分含量較低，難以得到用于建模的陰性對照品，存在一定的局限性。目前只能作常量分析，尚難進行痕量分析。因此，該方法適用于對少量可疑中成藥及保健品中是否添加西地那非類的快速篩查。

2.2 核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)

核磁共振波譜是準確解釋已知化合物和新化合物結(jié)構(gòu)的重要方法。其基本原理是強磁場中，某些元素的原子核和電子能量本身所具有的磁性，被分裂成兩個或兩個以上量子化的能級，吸收適當頻率的電磁輻射，可在所產(chǎn)生的磁誘導能級之間發(fā)生躍遷。在磁場中，這種帶核磁性的分子或原子核吸收從低能態(tài)向高能態(tài)躍遷的兩個能級差的能量，會產(chǎn)生共振譜，可用于測定分子中某些原子的數(shù)目、類型和相對位置。其中1H NMR、13C NMR、1D、2D NMR是最常見的核磁共振實驗方法，它們不僅可以用于結(jié)構(gòu)闡明，也可以用于鑒別量化。NMR具有樣品制備簡單、重現(xiàn)性高的特點，但不能否認其靈敏度較之前兩種為低。Gilard等收集了150個中草藥制劑樣本，利用NMR檢測摻雜物的存在，樣品經(jīng)氘代乙腈與氘代水(80∶20)混合液提取，對2D DOSY1H NMR譜的特征信號(H15，H17，H18)，定量檢測到61%的樣品中添加了PDE-5抑制劑[13]。NMR作為一種鑒別的手段，更廣泛地運用于檢測過程中最后的結(jié)構(gòu)確證環(huán)節(jié)，以此來與其他方法互為補充，如文獻報道，周建良等采用超高分辨的線性離子阱-靜電場軌道阱質(zhì)譜檢出未知的西地那非衍生物，并與二級質(zhì)譜作比較，進一步推斷衍生物的結(jié)構(gòu)，最后利用1H NMR、13C NMR、DEPT和HMBC譜對新的衍生物結(jié)構(gòu)確證，鑒定衍生物為丙氧酚艾地那非[14]。同樣，文獻中對于檢測到的新的摻雜西地那非衍生物Piperazinonafil，也是利用NMR(包括DEPT、HSQC、HMBC、H,H-COSY、H,H-TOCSY、H,H-NOESY等)與其他方法互為補充進行結(jié)構(gòu)鑒別和確定的[15]。

2.3 色譜法

2.3.1薄層色譜法及其聯(lián)用技術(shù)

薄層色譜法 (thin layer chromatography，TLC) 是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)，可以用于進行藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。由于它的簡單和廉價，所以它可以用來進行一些已知的西地那非衍生物的初步鑒別及中藥保健品中那非類衍生物的快速篩選[16]。Cai等[16-17]利用簡單的TLC，以合適的流動相可以鑒別8種PDE-5抑制劑。張振華等[18]使用GF254薄層板，乙醇-正己烷-氨水(70∶30∶1)為展開劑，在紫外光燈(254 nm)下檢視樣品中含有枸櫞酸西地那非。此外，Reddy等[19]采用硅膠60 F 高效薄層層析(HPTLC)預制板,以甲苯-丙酮-甲醇(6∶2∶2)為流動相，建立了高效薄層層析色譜方法，在標準品的參照下，定量測定出中草藥保健品制劑中含枸櫞酸西地那非76.4～85.0 mg。與TLC法相比，其靈敏度有所提高，并且可以通過斑點密度分析進行定量，前提是均需有參考類似物的標準品。薄層色譜法雖然操作簡單、便捷、廉價等優(yōu)點，被廣泛應用于藥物分析當中，但是由于分離時間較長，需要有特殊的顯色設(shè)備或顯色試劑，靈敏度差，分離效率不高，無法重復使用等缺點，極大的限制了TLC法的使用，因此TLC法較適合于條件有限的基層藥品監(jiān)督管理部門日常的監(jiān)督檢驗工作。

表面增強拉曼光譜法(SERS)是一種高靈敏、高專屬的新型譜學技術(shù)，將TLC法與SERS法相結(jié)合，利用TLC法富集待檢成分，用SERS法進行定性鑒別。該技術(shù)已應用于中成藥、保健品非法添加化學藥品[20-22]。李啟紅[23]用甲醇-水-氨水(75∶25∶1)混合液提取樣品，通過薄層色譜初步分離添加成分與基質(zhì)，對制備的薄層斑點滴加銀膠，采集SERS圖譜，與已知對照品的薄層表面增強拉曼光譜進行對照，在中藥保健品中快速檢測出3種非法摻入的PDE-5抑制劑，該方法中西地那非的最低檢測限達0.05%，點樣沉積量為0.05 μg。在中藥保健品基質(zhì)有干擾，肉眼幾乎不能辨別樣品與對照品Rf值處的斑點時，建立TLC-SERS方法，操作簡便，具有良好的可行性，降低漏檢風險，也是現(xiàn)場快速檢測篩查非法添加物的一個重要手段。

2.3.2高效液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)

在藥物檢測分析中，高效液相色譜法(HPLC)是最常用的分析方法之一，具有快速、高效、靈敏和重現(xiàn)好的優(yōu)點，廣泛用于中藥保健品中非法添加的那非類物質(zhì)的初步篩選[6-7,24]。Fej?s等[25]利用高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)成功篩選了補腎壯陽藥類中保健食品中添加西地那非、伐地那非、他達拉非等11種PDE-5抑制劑，采用Kinetex C18色譜柱，200 mmol/L乙酸銨及等體積比的甲醇乙腈為流動相，檢測波長290 nm。結(jié)果11種對照品濃度在相應的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r2≥0.998 2)，定量限為0.025～0.065 μg/ml，檢測限在0.008～0.022 μg/ml范圍內(nèi)。該方法簡單易行，成本低，可以基本確定樣品中是否含有某一化學成分。

另外一種超高效液相色譜(ultra high-pressure liquid chromatography，UHPLC)[26]。Sacré等[27]采用UHPLC的方法，在4.5 min內(nèi)實現(xiàn)了3種已知的PDE-5抑制劑和5種結(jié)構(gòu)類似物的分離，大大減少了分析時間。無論是HPLC還是UHPLC，均需要先獲得標準物質(zhì)的紫外光譜與保留時間，才能對樣品中添加的化合物進行定性，對未知化合物來說，最終是需要質(zhì)譜來輔助完成結(jié)構(gòu)鑒定。

質(zhì)譜法(mass spectrometry,MS)是應用多種離子化技術(shù)，將物質(zhì)分子轉(zhuǎn)化氣態(tài)離子并按質(zhì)荷比(m/z)大小進行分離記錄信息，是目前結(jié)構(gòu)解析的首選方法。質(zhì)譜類型多種多樣，包括離子阱質(zhì)譜(IT MS)、四極桿質(zhì)譜(Q MS)、分行時間質(zhì)譜(TOF MS)、靜電場軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap MS)等。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的進步，將兩個或多個質(zhì)譜(MS/MS,MSn)聯(lián)用，能準確獲取未知結(jié)構(gòu)的碎片離子的特征信息。比如，西地那非可以通過特征碎片離子m/z377，311和283，硫代西地那非(m/z299)，他達拉非(m/z268，262，250)和伐地那非(m/z461，377，299)進行類似物的鑒別[5]。Singh等[28]全面分析了具有共同母核結(jié)構(gòu)的西地那非C23H32N6O4S(488.220 6)，闡述了m/z377，m/z311為判斷摻雜西地那非及衍生物的特征碎片離子。

Zou等[29]建立了LC-DAD和 LC-ESI-MS/MS同時定量測定中藥保健品中添加的6種PDE-5抑制劑，選用0.01 mol/L甲酸胺水溶液和乙腈為流動相，于225、230和290 nm處的強紫外吸收波長，結(jié)合其不同的保留時間作快速初步鑒定。在多反應監(jiān)測(MRM)模式掃描下獲取特征產(chǎn)物離子，最終選擇m/z475/283(西地那非)、489/312(伐地那非)、390/288(他達拉非)、489/283(豪莫西地那非)、505/487(羥基豪莫西地那非)和467/297(紅地那非)作鑒定。該方法其靈敏度高，檢出限范圍在0.9～2.0 ng，已成功應用于一種膳食補充劑和6種預混散裝粉末樣品。

高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(HPLC/Q-TOF-MS)，飛行時間(TOF)技術(shù)在高分辨質(zhì)譜儀上能夠提供精準的質(zhì)量，精度可達4～6位小數(shù)。于泓等[30]運用UHPLC/Q-TOF-MS建立了一種快速檢測31種PDE-5抑制劑的方法。采用0.1%甲酸-乙腈溶液按梯度洗脫，ESI源正離子的模式采集，建立對照品保留時間、精確相對分子量和二級碎片譜庫。歸納了西地那非、他達拉非、伐地那非3種結(jié)構(gòu)類型的ESI質(zhì)譜裂解規(guī)律，其中西地那非類特征碎片離子為377.127 8(C17H21N4O4S)，311.150 8(C17H19N4O2)，283.119 5 (C15H15N4O2)；伐地那非類豐度較高的主要特征離子為：312.158 2(C17H20N4O2)，284.126 6 (C15H16N4O2)，151.086 6(C8H11N2O)；他達拉非類在質(zhì)譜中容易碎裂，碰撞能量較低為10～20 eV，特征碎片離子為：135.044 1(C8H7O2)，262.086 3(C17H12NO2)，268.108 1(C15H14N3O2)。結(jié)果對市售的164批中成藥保健品，取一次服用量的樣品經(jīng)甲醇超聲溶解處理后，檢出了26批陽性樣品，其中25批次內(nèi)含有9種西地那非類似物，最低檢出量僅含3.62 μg。

另外，線性離子阱-靜電場軌道阱-高分辨質(zhì)譜(LTQ Orbitrap MS)作為一種新的液質(zhì)聯(lián)用方法其分辨率較高，并且能進行多級質(zhì)譜分析。周建良等[14]利用LTQ Orbitrap MS的超高分辨率準確判斷了未知衍生物中含S元素，且只含1個S，結(jié)合精確質(zhì)量數(shù)和同位素豐度比對，證實“強力V 1型羊肚菌補腎精華粉”中摻雜了一種新型西地那非衍生物為丙氧酚艾地那非C24H34N6O4S(m/z503.24367)，且同位素與理論值一致。

高效液相色譜及其聯(lián)用是最常用的檢測方法，具有液相高效的分離能力和質(zhì)譜高專屬性的特性，能確證鑒別中藥保健品中非法添加多種PDE-5抑制劑類化學物質(zhì)，可以通過已知化合物離子的裂解規(guī)律、精確的質(zhì)量數(shù)，可以區(qū)分同分異構(gòu)體，還可發(fā)現(xiàn)并確證未知化合物，為打擊非法添加行為提供有力的技術(shù)支持。

2.3.3氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)

GC-MS法的基本原理是通過以惰性氣體為流動相，將樣品氣化分離，再經(jīng)質(zhì)譜離子化和質(zhì)量分析從而檢測分子離子和碎片離子。相比較LC-MS法，GC-MS法因為有強大的化合物搜索譜庫，對標準品的需求相對較低。但其缺陷是僅可以檢測出具有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的樣品。Mokhtar等人采用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法，在未經(jīng)衍生化的中藥保健品中，成功檢測出摻雜的西地那非及其衍生物。該實驗在Bruker Scion 456 TQGC-MS/MS系統(tǒng)中使用bpx5毛細管柱進行分離，利用不同的電離技術(shù)獲取每個碎裂模式進行類似物的鑒定，如西地那非，m/z99由哌嗪環(huán)和磺酰基之間裂解產(chǎn)生的特征離子；二甲基西地那非，特征離子m/z113由根據(jù)母體西地那非與哌嗪相連的甲基；特征離子m/z328和299為硫代那非類似物等[31]。但由于GC-MS對樣品的特殊要求，通常是通過樣品衍生化處理，或者水解作用，來提高檢測靈敏度，如紅地那非(noracetildenafil)[32]，艾地那非(aildenafil)[33]，硫代艾地那非(thioaildenafil)[34]均以酸水解產(chǎn)物來獲得有用的結(jié)構(gòu)信息，與其他方法一起作補充檢測用。

2.4 其他方法

2.4.1X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)

XRD的工作原理是以單色X射線通過晶體結(jié)構(gòu)時發(fā)出的X衍射來確定化合物的結(jié)構(gòu)，它具有快速可靠的特點，并且已經(jīng)被探索出用來檢測保健品中摻雜的PDE-5抑制劑的方法，有文獻報道利用XRD可以對一種新的西地那非衍生物的結(jié)構(gòu)進行描述并合成[35]，這也是XRD的新的運用。由此發(fā)展出來的X射線熒光(XRF)也可以用來檢測那非類衍生物，有文獻報道利用XRF檢測摻雜的枸櫞酸西地那非是一個極佳的檢測方法[36]。

2.4.2離子遷移譜(ion mobility spectroscopy，IMS)

IMS是根據(jù)其載體緩沖氣體的遷移率來分離和鑒定化學物質(zhì)的一種高通量分析技術(shù)[34]，而離子遷移率取決于分子離子的大小，形狀和電荷。由于其高速、靈敏，選擇性和低成本，它可以用來作為篩選工具檢測摻假，有文獻報道IMS方法在摻PDE-5抑制劑產(chǎn)品檢測中的運用[37]。另外，有文獻報道利用IMS對摻雜的保健品中紅地那非，西地那非和伐地那非進行快速的篩選[38]。

2.4.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immuno- sorbent assay，ELISA)

免疫分析方法在摻PDE-5抑制劑檢測中也得到極大的探索和研究，其中ELISA是基于使用特定類型的單克隆抗體，并利用抗原抗體結(jié)合專一性進行免疫反應的定性和定量檢測，因而這種方法具有快速，靈敏和特異性強的特點。但它也存在局限性，主要在于以下幾個方面：①該法重復性不好；②受抗體干擾，容易出現(xiàn)假陽性；③受溫度和時間干擾。

Guo等人利用ELISA來制備伐地那非及其衍生物piperidenafil和desulfovardenafil的特異性單克隆抗體，來快速篩選該種衍生物[39]；也有文獻報道開發(fā)了一種快速競爭的ELISA，并采用多克隆抗體西地那非KLH，該抗體具有較高的敏感性和特異性，可快速檢測保健品中西地那非[40]。另一篇最新的文獻中報道，IC法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的西地那非及其類似物的多克隆抗體可以在ELISA中顯示出較好的特異性，研究人員對60種保健品添加劑進行西地那非及類似物的篩選，其結(jié)果證明該法是一種合適的檢測篩選工具[41]。

2.4.4免疫膠體金法(immune colloidal gold technique，GICT)

免疫層析法在檢測那非類衍生物中的運用主要是以膠體金為顯色媒介，故又稱為膠體金免疫層析法，它是以抗原與抗體特異性結(jié)合并在膠體金上層析顯色為原理的一種檢測方法，具有特異性強，靈敏度高和成本低的特點，但它存在的局限性是由于它的特異性較強，對于非同種的那非類化合物的同系物則無法識別檢測，而且對于陽性的檢測結(jié)果無法判斷其衍生物的具體結(jié)構(gòu)。有文獻報道周天祥等利用一種含有抗西地那非單克隆抗體的試劑盒，對在實驗室中用HPLC-MS/MS法判定為合格(未檢出西地那非) 和不合格(檢出西地那非) 的樣品進行篩查具有較高的準確率[42]；另外也有文獻報道利用IC法對60種中藥保健品添加劑進行篩選，結(jié)果證明該法對于檢測那非類藥物及其類似物確實是一種有效的工具和手段[41]。

3 總結(jié)

目前，天然產(chǎn)品中違法添加化學藥物已經(jīng)成為全球性的問題，在中藥保健品種不斷出現(xiàn)PDE-5抑制劑的結(jié)構(gòu)類似物，對消費者健康帶來極大的危害性，而且對食品藥品監(jiān)督管理部門的檢測工作提出更高的技術(shù)要求。綜上所述，一般在現(xiàn)場檢查中可以采用IR法、NIR法、TLC-SERS法等相對簡單、易操作，成本低的檢測方法進行快速篩選檢驗，擴大監(jiān)管范圍，提高檢查效率；對疑似樣品采用國家標準規(guī)定的檢驗方法HPLC法、LC-MS/MS法、HPLC-TOF/MS等對其進行最終的定性及定量檢測，對不法廠商的違法犯罪行為提供檢驗依據(jù)；對檢測到新的摻雜那非類衍生物，利用NMR、GC-MS等檢測方法進行結(jié)構(gòu)鑒別和確證，做補充研究；同時不斷探索和研究IMS，ELISA等檢測技術(shù)的應用，我們相信那非類衍生物摻雜的研究方法必將為保健品和食品的安全不斷貢獻力量。