豬抗凝全血樣品檢測(cè)非洲豬瘟?xí)r凝膠產(chǎn)生原因及避免措施探討

羅嘉軒，馮云云

（1.江門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心廣東 江門 529051；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣州 510642）

隨著非洲豬瘟的防控工作進(jìn)入常態(tài)化和長(zhǎng)期化的階段，檢測(cè)非洲豬瘟的數(shù)量和頻率也在上升[1]。在生豬調(diào)運(yùn)、供港供澳、常規(guī)監(jiān)測(cè)以及流行病學(xué)調(diào)查等工作中常常都會(huì)采集豬的抗凝全血樣品，而根據(jù)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心和中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心于2018 年8 月聯(lián)合編制的《非洲豬瘟病毒檢測(cè)操作規(guī)程（試行）》，檢測(cè)樣品應(yīng)在60℃水浴30min 進(jìn)行病毒滅活。

在滅活過程中樣品常出現(xiàn)凝膠，難以通過移液槍吸取，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[2]。為了解凝膠產(chǎn)生原因，更好地為實(shí)驗(yàn)開展提供參考，筆者對(duì)380 份豬全血樣品進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣品來源、抗凝劑及狀態(tài)

樣品共360 份，來源為廣東省江門市及陽江市的供港豬場(chǎng)，其中280 份來自于江門市，80 份來自于陽江市。樣品均由相同的人員進(jìn)行采集，采樣人用注射器采集后保存于抗凝管中，抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉。樣品和冰袋一同放置于泡沫箱中進(jìn)行送樣，接樣時(shí)樣品狀態(tài)正常，呈液體狀，無凝膠、沉淀物產(chǎn)生。

1.2 樣品檢測(cè)方法

用一次性巴氏吸管吸取樣品到1.5mL 離心管中，10,000r/min 離心3min，用一次性巴氏吸管把上清液轉(zhuǎn)移到新1.5mL 離心管中，用干式恒溫金屬浴進(jìn)行60℃30min 金屬浴滅活病原，觀察樣品形態(tài)。

1.3 樣品分組情況

樣品分為三組。第一組樣品于2019 年6 月3 日采集，共180份，來自9 個(gè)豬場(chǎng)，其中7 個(gè)來自于江門市，2 個(gè)來自于陽江市，樣品采集后放置于-20℃保存，次日進(jìn)行血清分離。第二組和第三組于2019 年6 月17 日采集，兩組共180 份，來源場(chǎng)和第一組相同，其中有100 份于17 日當(dāng)天進(jìn)行血清分離，為第二組，另外80 份保存于4℃并于18 日進(jìn)行血清分離，為第三組。

2 結(jié)果

離心前三組樣品均為液態(tài)，其中第一組顏色與第二、第三組相比偏黑。離心后第一組呈液態(tài)、顏色均勻、無明顯上清液產(chǎn)生，第二和第三組明顯分層，上層為澄清液體，下層為沉淀物，其中第三組顏色較第二組偏紅。

金屬浴滅活后，第一組基本都呈現(xiàn)暗黑色凝膠狀半固體，部分凝固程度較高的樣品用移液槍吸取樣品有困難，第二和第三組均呈液態(tài)，用移液槍吸取操作無障礙。

3 結(jié)果分析

第一組和第二、第三組耗材及樣品采集方式、采集人員相同，可排除采樣人員、耗材因素對(duì)結(jié)果影響。第一組和第三組的樣品來自相同的場(chǎng)，樣品的保存時(shí)間相同，保存溫度不一致，結(jié)果第一組均產(chǎn)生凝膠，第三組均未產(chǎn)生凝膠，足以證明在零度以下環(huán)境保存是產(chǎn)生凝膠的關(guān)鍵原因之一。

第二組和第三組的保存溫度相同，保存時(shí)間不一樣，而兩組均未產(chǎn)生凝膠，也可從側(cè)面反映保存時(shí)間的差異與凝膠的產(chǎn)生相關(guān)性不大。而第一組凝膠主要在金屬浴后產(chǎn)生，樣品在金屬浴之前均為液態(tài)，金屬浴后均為凝膠態(tài)，形成自身前后對(duì)比，證明金屬浴是產(chǎn)生凝膠的關(guān)鍵原因之一。

由于在實(shí)驗(yàn)中證明了在零度以下環(huán)境保存和金屬浴兩者為凝膠產(chǎn)生的必要因素，缺一不可。故推測(cè)有可能是樣品保存于零度以下環(huán)境時(shí)，紅細(xì)胞細(xì)胞膜由于結(jié)冰而破裂釋放出血紅蛋白，隨后金屬浴時(shí)加熱使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，氫鍵等次級(jí)鍵被破壞，形成沉淀以及粘度增加，導(dǎo)致凝膠產(chǎn)生。

4 避免措施

由于缺乏豬全血非洲豬瘟陽性樣品，尚不知凝膠的產(chǎn)生對(duì)檢測(cè)結(jié)果是否有影響，但其粘稠度較大，影響實(shí)驗(yàn)操作，故在實(shí)際工作中應(yīng)采取措施來避免凝膠的產(chǎn)生。主要的措施有注意采樣送樣的時(shí)效性以及采樣后盡快進(jìn)行血清分離，如果不能當(dāng)天進(jìn)行分離，應(yīng)于2～8℃進(jìn)行冷藏保存，避免在0℃以下環(huán)境保存。