基于高通量測序的不同窖齡窖泥微生物結構與多樣性分析

張應剛，鄧 宇

(農(nóng)業(yè)部沼氣科學研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室，成都 610041)

濃香型白酒是指以高粱、大米、玉米等糧谷為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，具有以己酸乙酯為主體香的白酒。濃香型白酒的風格特征主要為“窖香濃郁，綿甜醇厚，香味協(xié)調(diào)，回味悠長”[1]，其產(chǎn)量占據(jù)了我國每年白酒總產(chǎn)量的70%以上[2]。濃香型白酒的香氣成分主要來源與大曲微生物、糟醅微生物、窖泥微生物以及生產(chǎn)環(huán)境中微生物代謝產(chǎn)生，其中濃香型白酒中的窖香主要來源于窖泥微生物產(chǎn)生[3]。窖泥作為濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物棲息的主要生態(tài)環(huán)境之一，常年處于低pH值、高水分、高靜壓、兼性厭氧的窖池中，這給窖泥微生物的生長、優(yōu)化提供了特殊的棲息環(huán)境[4]。

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術的快速發(fā)展，研究者們大量利用DGGE指紋圖譜技術[5]、熒光定量PCR[6-8]、,16S rRNA基因克隆測序和高通量測序技術等多種技術手段[9-11]對不同產(chǎn)區(qū)、同一窖泥的不同位置以及不同窖齡的窖泥微生物進行微生物多樣性和生態(tài)學研究。不同窖齡、不同產(chǎn)區(qū)以及同一產(chǎn)區(qū)的環(huán)境因子與微生物的群落結構有明顯不同[12-14]，這些不同能夠影響窖泥中的微生物的相互作用關系，也能影響濃香型白酒的香味物質(zhì)成分和含量。本章通過利用高通量測序技術對不同窖齡窖泥樣品(5年、25年、70年)進行分析，進一步的了解不同窖齡窖泥細菌和古菌的微生物的組成和微生物多樣性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料(只標注主要的)：四川成都某酒廠不同窖齡窖泥樣品(5年、25年、70年)；QIAGEN PowerSoil?DNA Isolation Kit，German；無水乙醇，化學純，國藥；Na2HPO4,KH2PO4,NaCl,KCl，SIGMA-ALDRICH。

1.2 儀器與設備

HVE-50高壓滅菌鍋：Hirayama；Centrifuge 5418 臺式離心機：eppendorf；PowerPac 電泳儀：Bio-Rad；QL-901 微型漩渦混合器：江蘇南海市某儀器制造有限公司；GL150 金屬?。航K南海市某儀器制造有限公司；LX-200 手掌型離心機：江蘇南海某儀器制造有限公司；NanoDrop ND-1000 微量紫外可見分光光度計：Nanodrop。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

窖泥樣品的DNA的提取采用QIAGEN PowerSoil?DNA Isolation Kit，具體的實驗步驟參見說明書。對提取的DNA純度和濃度檢測利用nano測定儀進行測定，直接讀出DNA的濃度，主要對260 nm，280 nm處的吸光值進行分析，以A260/A280的比值作DNA純度的衡量標準。

1.3.2 PCR擴增以及高通量測序

用檢測后的合格的基因組DNA稀釋后作為模板，PCR 擴增采用細菌16S V3+V4可變區(qū)的引物341F (5’-CCTAYGGGRBCGASCAG-3’)和806R (5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)，古菌的V4+V5的可變區(qū)的引物519F (5’-CAGCCGCCGCCGCGGTAA-3’)和915R (5’-GTGCTCCCCCGCCAATT CCT-3’),并且使用帶Barcode的特異引物，New England Biolabs 公司的 Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。PCR 擴增反應程序:98 ℃預變性1 min;30個循環(huán)包括(98 ℃變性10 sec;50 ℃退火30 sec;72 ℃擴增30 sec)；72 ℃再延伸5 min。采用Bio-rad T100 梯度PCR 儀擴增，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，割膠回收目標條帶。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫的構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用HiSeq進行上機測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用Cutadapt軟件過濾和按barcode拆分樣本后，進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結果，一方面對每個OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時，對OTUs進行豐度、Alpha多樣性計算、Venn圖和花瓣圖等分析，得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs信息等。另一方面，對OTUs進行多序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)生樹，并進一步得到不同樣品和分組的群落結構差異，通過PCoA和PCA,NMDS等降維圖和樣品聚類樹進行展示。通過Simper定量分析物種對組間差異的貢獻度。為進一步挖掘分組樣品間的群落結構差異，選用T-test,MetaStat,LEfSe,Anosim和MRPP等統(tǒng)計分析方法對分組樣品的物種組成和群落結構進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 窖泥樣品微生物多樣性分析

對3個不同窖齡的窖泥的OUT數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)進行比較分析(見表1)，在5年,25年，70年3個不同年代的窖池窖泥中分別檢測到507，443，530個細菌OUT和19，15，17個古菌OUT，隨著窖齡的增加，窖泥微生物的OUT數(shù)呈現(xiàn)一個先降低再增加的趨勢。

在不同的窖齡的窖池中，菌群的shannon index有比較明顯的差異，并與窖齡的變化趨勢呈負相關，隨著窖齡的增加，窖泥的細菌和古菌多樣性降低。而從chao 1數(shù)據(jù)來看，隨著窖泥窖齡的增加，窖泥中細菌的總物種數(shù)增加，古菌的總物種數(shù)先降低后增加。窖泥在經(jīng)過長時間的周期性的開窖、封窖發(fā)酵的周期性過程，窖泥中的物種多樣性降低，細菌的總物種數(shù)有一定的增加，古菌的總物種數(shù)會降低而后輕微增加。這跟鄧杰[15-16]、施思[4]等結果有差異。新窖泥中含有很多雜菌，隨著窖泥老化過程的進行，雜菌減少，微生物多樣性降低，而適應窖泥環(huán)境的優(yōu)勢物種被大量富集。老窖出好酒，老窖釀造的濃香型白酒香氣成分協(xié)調(diào)，本結果表明隨著窖泥的長時間的馴化，優(yōu)勢細菌的富集可能跟窖泥質(zhì)量和白酒香氣成分的種類和含量有密切的聯(lián)系。

表1 不同窖齡窖泥的細菌和古菌群落多樣性指數(shù)

2.2 Beta 多樣性

根據(jù)聚類分析顯示，細菌的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻率分別達到了22.1%和14.4%(見圖1)。3個不同窖齡窖泥的細菌均分布在PC1和PC2的區(qū)域內(nèi)，并且每個年代窖泥樣品的細菌很好的集中在一個簇，3個年代窖泥的細菌分布在3個不同的簇中。古菌的主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的樣品差異性貢獻率分別達到了29.3%和15.33%(見圖2)。同樣的，不同窖齡窖泥的古菌分布在3個不同的簇中，并且相對集中。結果表明同意窖齡窖泥的微生物能夠很好的集中在一個簇中，組內(nèi)群落結構相似。不同窖齡窖泥的微生物分布在不同的3個簇中，組間的主成分差異顯著，細菌和古菌的群落結構發(fā)生了顯著的變化。窖泥的微生物群落結構跟窖泥的窖齡有顯著的關系。

圖1 細菌群落的主成分分析

圖2 古菌群落的主成分分析(3D-PCA)

2.3 細菌群落分布特征分析

2.3.1 不同窖齡窖泥細菌群落在門水平上的組成

基于16s高通量測序的序列數(shù)據(jù)分析表明，3個不同年代，15個窖泥樣品中細菌主要分布在28個門，40個綱，86個目，159個科和349個屬。這些細菌主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、變形桿菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Cloacimonetes、放線菌門(Actinobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、生氧光細菌門(Oxyphotobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和 Armatimonadetes等多個門類。在5年窖齡窖泥中，占優(yōu)勢的微生物主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，其相對豐度分別為53.17%，41.89%和3.6%。在25年窖齡窖泥中，占優(yōu)勢的物種主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和Cloacimonetes，相對豐度分別為70.88%，22.91%和3.86%。而在70年窖齡窖泥中，主要的微生物分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)，相對豐度分別為88.75%，4.14%和2.77%(見圖3)。

結果表明，從門的分類水平來看，伴隨著窖泥老化的過程，厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度增加，相對豐度從53.17%增加到88.75%。在5年窖齡窖泥中占有非常高的豐度的變形桿菌門(Proteobacteria)隨著窖泥老化的過程，相對豐度降低，在25年和70年豐度僅僅只有0.56%和0.9%。在窖泥中，變形桿菌門(Proteobacteria)隨著時間的增長，逐漸被淘汰。而在25年中相對豐度較高的擬桿菌門(Bacteroidetes)，在窖泥老化的前期相對豐度有很明顯的富集，伴隨著窖泥的老化完成，在70年窖泥中，相對豐度逐漸變化為4.14%。窖泥的老化主要是厚壁菌門(Firmicutes)不斷富集的過程。

圖3 不同窖齡樣品細菌門水平分布

2.3.2 不同窖齡窖泥細菌群落在屬水平上的組成

為了對不同窖齡窖泥功能微生物的變化進一步的分析，對3個年代的樣品的細菌的相對豐度進行統(tǒng)計。結果顯示，在3個不同窖齡窖泥樣品中，主要的優(yōu)勢物種為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)、阿姆莫利菌屬(Ampullimonas)、三角菌屬(Petrimonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、Anaerocella、產(chǎn)乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)、曲桿菌屬(Curvibacter)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)(見圖4)，這些微生物主要代謝產(chǎn)生乙酸、丁酸、乳酸、乙醇、己酸以及精氨酸等白酒重要的風味物質(zhì)或者風味物質(zhì)的前體物質(zhì)[17-24]。5年窖齡窖泥中主要的細菌為阿姆莫利菌屬(Ampullimonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和曲桿菌屬(Curvibacter)，相對豐度分別為27.66%、13.94和5.98%。而在25年窖齡窖泥中，主要的優(yōu)勢細菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)(40.40%)、理研菌屬(Petrimonas)(12.70%)和產(chǎn)乙酸嗜蛋白菌屬(Proteiniphilum)(5.06%)。在70年窖齡窖泥中，優(yōu)勢細菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)(24.49%)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(2.78%)。

在5年窖齡中絕對的優(yōu)勢物種Ampullimonas、Lactobacillus，隨著窖齡的增加，相對豐度顯著減少，在25年窖泥中豐度僅有0.15%和1.17%，隨著窖齡進一步增加，豐度略微有所提升，豐度為0.24%和2.77%。Ampullimonas為好氧菌，Ampullimonas豐度的降低，跟窖泥的厭氧環(huán)境有關。乳桿菌是窖泥中的重要微生物，代謝產(chǎn)生的乳酸濃香型白酒的香味物質(zhì)和香味物質(zhì)的前體物質(zhì)。并有研究認為，在早期窖泥中，高豐度的Lactobacillus及其代謝產(chǎn)物可能在維護與保持窖泥低 pH 環(huán)境，抑制雜菌，馴化有益菌方面發(fā)揮重要作用[25]。值得注意的是，5年窖齡窖泥中豐度僅有2.53%的Caproiciproducens隨著窖齡的增加，豐度增加，在25年和70年窖齡中都是絕對的優(yōu)勢物種，在25年和70年窖齡窖泥中，相對豐度為40.40%和 24.49%。Caproiciproducens是一株代謝能夠產(chǎn)生氫氣、丁酸和己酸的一類細菌，在成熟窖泥中如此高的豐度，可能為濃香型白酒提供了最重要的香味物質(zhì)己酸乙酯提供前體物質(zhì)己酸[19]。一般和產(chǎn)甲烷古菌互營的Syntrophomonas隨著窖泥窖齡的增加，豐度也有明顯的增加，豐度從0.07%增加到了1.29%，隨著窖齡進一步的增加，豐度又減少到了0.47%。Syntrophomonas能夠降解長鏈脂肪酸或丁酸產(chǎn)生氫氣、乙酸、丙酸[26]。

圖4 不同窖齡樣品細菌屬水平分布

2.4 古菌群落分布特征分析

2.4.1 不同窖齡窖泥古菌群落在門水平上的組成

在窖泥樣品中，古菌的微生物群落變化相對簡單。3個不同年代，15個窖泥樣品中古菌主要分布在3個門，8個綱，11個目，14個科和21個屬。這些古菌主要分布在廣古菌門(Euryarchaeota)、奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)和未分類的門內(nèi)。5年窖齡窖泥中的古菌多樣性相對比較豐富，除了分布在廣古菌門(Euryarchaeota)外，還分布在奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)和一些未分類的門內(nèi)。25年窖齡窖泥中的古菌多樣性很單一，只分布在廣古菌門(Euryarchaeota)內(nèi)。而70年窖齡窖泥中的古菌分布在廣古菌門(Euryarchaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota)。其中在3個年代的窖齡樣品中都占有最高豐度的廣古菌門(Euryarchaeota)在5年、25年和70年窖齡窖泥中分別占了96.50%，100%和99.81%(見圖5)。

圖5 不同窖齡樣品古菌門水平分布

2.4.2 不同窖齡窖泥古菌群落在屬水平上的組成

在屬的水平上，采用細菌多樣性的分析方法，得到了3個不同樣品的古菌的相對豐度圖，結果表明，古菌的優(yōu)勢物種主要有Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium,Methanobrevibacter,Methanosarcina,Methanoculleus,Methanocorpusculum,Methanosaeta和Methanocella。5年窖齡窖泥中優(yōu)勢古菌微生物為Methanobacterium,Methanobrevibacter,Methanosarcina和Methanoculleus，相對豐度分別為13.06%，26.39%，22.56%和9.36%。在25年窖齡窖泥中，優(yōu)勢古菌微生物為Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium和Methanoculleus，相對豐度分別為27.71%,30.15%和23.48%。而在70年窖齡窖泥中，優(yōu)勢古菌微生物主要為Candidatus_Methanoplasma,Methanobacterium和Methanobrevibacter，相對豐度分別為36.97%,25.94%和21.67%(見圖6)。

圖6 不同窖齡樣品細菌屬水平分布

隨著窖泥窖齡的增加，Candidatus_Methanoplasma不斷富集，在70年窖齡窖泥中，豐度高達36.97%，Candidatus_Methanoplasma豐度顯著提高，表明其可能在老窖泥中的重要地位。在5年窖齡窖泥中的優(yōu)勢物種Methanosarcina隨著窖齡的增加豐度逐漸降低，在25年和70年窖齡的窖泥中豐度僅有8.90%和3.25%。Methanocorpusculum和Methanocella隨著窖齡增加，豐度逐漸降低，到70年窖齡中，基本被淘汰。從代謝水平上看，窖泥中的主要優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌都是多種營養(yǎng)類型的產(chǎn)甲烷古菌，主要利用氫氣和甲基類化合物，而只能以乙酸作為底物的Methanosaeta在所有窖齡窖泥中都不是優(yōu)勢古菌[27]，豐度極低。值得注意的是，窖泥中的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷古菌大多還能利用甲醇作為底物，窖泥中甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌還可能對濃香型白酒的質(zhì)量有著重要的關系。Candidatus_Methanoplasma和Methanosarcina在隨著窖齡的增加有明顯的正負相關性，或許可以作為新老窖泥判斷的標準。

筆者發(fā)現(xiàn)窖泥中的Caproiciproducens是豐度最高的具有產(chǎn)己酸能力的細菌，H2是其的主要代謝副產(chǎn)物，并且窖泥中的氫營養(yǎng)型的Methanobacterium與Caproiciproducens在窖泥中隨年代的增加有同步變化的趨勢。這為前人提出的甲烷古菌常和產(chǎn)己酸菌互營，并通過種間“氫轉移”作用解除氫抑制，從而使反應向有利于產(chǎn)生己酸的方向進行的假說提供了有力的證據(jù)[28]。

3 結論

通過 16S r RNA 高通量測序解析四川成都某酒廠的3個不同年代的窖泥樣品的細菌和古菌的群落結構，研究結果表明：

(1)窖泥微生物主要分布28個細菌門和3個古菌門，厚壁菌門、變形桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢的細菌門，古菌主要分布在廣古菌門。

(2)窖泥的優(yōu)勢微生物隨著窖齡的增加發(fā)生明顯的變化。隨著窖齡的增加，優(yōu)勢微生物從Ampullimonas和Lactobacillus變?yōu)榫哂挟a(chǎn)己酸能力的Caproiciproducens。

(3)窖泥中主要都是利用H2、甲酸、甲醇的產(chǎn)甲烷古菌，而利用乙酸的乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌不是窖泥中的優(yōu)勢物種。甲基營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷古菌可能對濃香型白酒的質(zhì)量有著非常重要的關系。Candidatus_Methanoplasma和Methanosarcina在隨著窖齡的增加有明顯的正負相關性，或許可以作為新老窖泥判斷的標準。

(4)窖泥中的氫營養(yǎng)型的Methanobacterium與Caproiciproducens在窖泥中隨年代的增加有同步變化的趨勢。這為前人提出的甲烷古菌常和產(chǎn)己酸菌互營，并通過種間“氫轉移”作用解除氫抑制，從而使反應向有利于產(chǎn)生己酸的方向進行的假說提供了有力的證據(jù)。