巨桉BRI1基因的克隆和表達(dá)分析

李曉丹, 胡冰, 裘珍飛, 范春節(jié), 閆慧芳, 曾炳山

巨桉基因的克隆和表達(dá)分析

李曉丹, 胡冰, 裘珍飛, 范春節(jié), 閆慧芳, 曾炳山*

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520)

為了解基因在巨桉中的功能，采用PCR技術(shù)克隆了基因，分析了EgrBRI1的生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位，并對基因響應(yīng)激素和脅迫的差異表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因全長3 893 bp，編碼1 197個氨基酸。EgrBRI1蛋白穩(wěn)定，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在3個motifs，主要定位于細(xì)胞膜。茉莉酸甲酯和油菜素內(nèi)酯(BR)處理后，基因在葉片中的表達(dá)上升，而水楊酸處理則沒有明顯的變化。鹽脅迫和冷脅迫下，基因表達(dá)表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢。因此，基因能快速對外施激素做出響應(yīng)，并在巨桉抗逆方面發(fā)揮重要作用，這可能是通過對BR信號的響應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。

巨桉; 油菜素內(nèi)酯;基因; 基因表達(dá)

油菜素內(nèi)酯(brassinolides, BR)是一種新型的植物激素，二十世紀(jì)70年代在油菜()花粉中發(fā)現(xiàn)。BR在植物中含量較少, 但活性極高[1]，且適用性廣、無毒，多存在于植物的生殖器官和營養(yǎng)器官中[2]。BR能調(diào)控植物細(xì)胞伸長和分化、維管組織分化、衰老、開花時間[3]、雄性育性、花粉發(fā)育、種子大小、光形態(tài)建成等一系列植物生長發(fā)育過程以及應(yīng)對生物和非生物脅迫等過程[4–5]。對油菜幼苗外施BR能促進(jìn)其體內(nèi)熱休克蛋白的積累，顯著增強(qiáng)耐熱性[6]；對大麥()施用BR能減少赤霉病危害，降低產(chǎn)量損失[7]。而BR缺失突變體或不敏感型突變體則會出現(xiàn)矮化、維管組織發(fā)育不正常、墨綠色葉、開花和衰老延遲、雄性不育、種子萌發(fā)率降低及黑暗條件下去黃化等表型[8]。

在BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，基因(brassinosteroid insensitive 1)編碼1個亮氨酸受體激酶, BRI1定位在細(xì)胞膜上，通過胞外的結(jié)構(gòu)域感受BR信號，啟動胞內(nèi)的激酶活性，使得抑制因子BKI1 (BRI1 kinase inhibitor 1)從BRI1上解離[9]，BKI1的解離促使BRI1與其共受體BAK1/SERK3 (BRI1-associated kinase 1/ somatic embryogenesis receptor-like kinase 3)相互作用[10]，接著通過一系列的激酶和磷酸酶的順序作用，繼續(xù)向下傳遞BR信號。BR信號通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BZR1 (brassinazole-resistant 1)和BES1 (BRI1- EMS-suppressor 1)從而被去磷酸化, 進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控BR相關(guān)基因的表達(dá)[11]。BRI1是1個細(xì)胞膜上的富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRRs)的類受體激酶，目前已發(fā)現(xiàn)20多個BRI1的突變體，都表現(xiàn)出葉片變圓、育性下降、衰老延遲等BR缺陷的典型特點(diǎn)[12]。

桉樹()又稱尤加利樹，是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬植物的統(tǒng)稱。桉樹原產(chǎn)地位于澳大利亞，近幾十年來已經(jīng)成為全球人工林最重要的造林樹種之一[13]。桉樹木材質(zhì)量優(yōu)良，是用來做家具和裝飾的理想材料。改良桉樹材性，不僅有利于我國森林資源的合理利用，而且可促進(jìn)國內(nèi)木材加工工業(yè)的持續(xù)發(fā)展[14]。巨桉()全基因組測序的完成，也為開展基因克隆和鑒定相關(guān)基因功能提供了寬廣的基礎(chǔ)平臺[15]。

BR信號需被BRI1蛋白感應(yīng)才能啟動一系列的信號級聯(lián)傳遞，鑒于BRI1在BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演的重要作用，本研究以巨桉材料，克隆了基因，采用實(shí)時熒光定量PCR對其在高鹽、低溫脅迫和BR、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)處理后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，同時還構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體，觀察巨桉BRI1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，另外還構(gòu)建了超表達(dá)載體，對其進(jìn)行功能鑒定，為探討桉樹次生維管發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理和分子育種提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為巨桉()無性系GL1，由中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所林木生物技術(shù)組培育。選擇生長狀況良好，高度為30~ 40 cm的幼苗。

大腸桿菌() Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、TA克隆載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國的英濰捷基公司；PCR高保真酶和PCR Mix購于美國紐英倫生物技術(shù)；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNaseI試劑盒購自德國凱捷(Qiagen)公司；DNA Marker購自上海捷瑞生物技術(shù)公司。引物合成和DNA測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 EgrBRI1基因克隆和生物信息學(xué)分析

總RNA的提取和cDNA的合成 使用EASY- spin植物RNA快速提取試劑盒(Aidlab)提取總RNA,采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測質(zhì)量，OD260/OD280為1.8~2.0，28S/18S約為2的RNA樣品進(jìn)行cDNA的合成。采用Invitrogen Superscript III，按照操作步驟獲得cDNA產(chǎn)物并置于–20℃冰箱保存。

基因克隆 利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)克隆基因的引物(表1)。以cDNA為模板采用Q5 High-Fidelity PCR Kit進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用20L反應(yīng)體系，其中退火溫度為62℃，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物采用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)進(jìn)行目的片段回收。

生物信息學(xué)分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建 將巨桉基因序列提交NCBI (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/WebSub/?tool=genbank), 登錄號為KP721492。通過ExPASy數(shù)據(jù)庫中的在線分析軟件ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)分析EgrBRI1蛋白的理化性質(zhì)[16]，利用RasMol/PyMOL軟件對EgrBRI1蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用在線軟件WoLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[17]。在NCBI的BLASTX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中查找不同植物的同源序列，選擇相似度較高的物種，與巨桉EgrBRI1氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，在MEGA 6.0軟件中構(gòu)建進(jìn)化樹, 進(jìn)化樹以Gblock多重比對下的平均距離樹(average distance tree)表示。

1.3 載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

載體構(gòu)建 回收的目的片段連接于pEASY- Blunt克隆載體，熱激法轉(zhuǎn)化。通過菌液PCR檢測,由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。采用Gateway法將目的基因構(gòu)建到pMDC32載體上，使用電擊轉(zhuǎn)化法，將載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌() GV3101。采取同樣方法構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

表1 文中所用引物

亞細(xì)胞定位 采用基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的亞細(xì)胞定位載體，通過基因槍法導(dǎo)入洋蔥()表皮細(xì)胞，采用熒光顯微鏡檢測該基因在細(xì)胞內(nèi)的瞬時定位表達(dá)情況。具體步驟如下: 首先將金粉消毒，然后與DNA包埋，取50L金粉懸浮液，加入5L (1gL–1) DNA+50L (2. 5 mol L–1) CaCl2+20L (0.1 mol L–1)亞精胺充分混勻渦旋, 9 391×離心30 s后倒掉上清液，然后加入250L預(yù)冷的無水乙醇，渦旋1~2 min；15 871×離心1 min后倒掉上清，用60L無水乙醇重懸沉淀物。

同時選取新鮮洋蔥，剝?nèi)ネ鈱樱媒馄实肚腥〉?~3層鱗莖，切成3 cm×3 cm方塊。用鑷子小心撕下內(nèi)表皮，將其置于高滲MS培養(yǎng)基中室溫培養(yǎng)2~4 h。選用900 psi的可裂膜，將10L微彈懸浮液置于轟擊膜中央，待風(fēng)干后進(jìn)行轟擊。采用PDS1000/He 型基因槍轟擊，轟擊微粒運(yùn)行距離為9/12 cm各1次，可裂膜與載體膜之間的距離為2.5 cm，載體與阻擋網(wǎng)之間的距離為0.8 cm，真空度為26~28 In·Hg。將轟擊后洋蔥表皮細(xì)胞在高滲MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)16~20 h后，轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后制片，置于倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axio Obrserver A1)下觀察。

1.4 EgrBRI1基因的差異表達(dá)

用0.1 mmol L–1茉莉酸甲酯(MeJA)、0.2mol L–1BR、0.1 mmol L–1水楊酸(SA)噴施處理，分別在0、1、6、24和168 h后取葉片；參考姚海榮等[18]的方法進(jìn)行鹽處理和冷處理，200 mmol L–1NaCl分別處理0、1、6、24和168 h后取葉片；冷處理為在4℃下分別培養(yǎng)0、2、4、24和48 h后取葉片。樣品采集后立即放入液氮內(nèi)，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆??；虻谋磉_(dá)分析使用Roche公司的Light Cycler96熒光定量分析儀，采用SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa)試劑盒進(jìn)行分析。cDNA樣品稀釋25倍, 程序?yàn)?5℃ 30 s→(95℃ 5 s→60℃ 34 s) 40個循環(huán), 溶解曲線程序?yàn)?5℃15 s→60℃1 min→ 95℃ 15 s。內(nèi)參基因?yàn)椤?/p>

2 結(jié)果和分析

2.1 EgrBRI1基因克隆和生物信息學(xué)分析

利用設(shè)計(jì)好的特異性引物(表1)對基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收目的片段并測序，片段長度為3 893 bp (圖1)。

切取目的片段凝膠回收基因片段，然后將回收產(chǎn)物連接于克隆載體，經(jīng)過篩選、PCR擴(kuò)增、測序分析和比對，證實(shí)獲得基因的核苷酸序列。經(jīng)過氨基酸預(yù)測分析，基因編碼1 197個氨基酸序列，其分子量為129 690.6 kD,理論等電點(diǎn)為6.01，不穩(wěn)定系數(shù)為35.4，EgrBRI1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，存在信號肽。脂肪系數(shù)97.37, 屬于親水性蛋白。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，-螺旋占35%，-轉(zhuǎn)角占8.69%，延展結(jié)構(gòu)為17.71%，無規(guī)卷曲占38.6%。蛋白無序性分析表明，EgrBRI1蛋白質(zhì)不規(guī)則區(qū)域數(shù)為7，無序化分值為0.202。亞細(xì)胞定位預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞膜上，存在跨膜區(qū)，存在長度為141個殘基的結(jié)構(gòu)域，共有3個motifs, 含有LRRNT_2 domain、LRR_1 domain、LRR_8domain以及Pkinase domain (圖2)。

圖1 EgrBRI1基因的擴(kuò)增

通過NCBI中的BLAST程序?qū)grBRI1蛋白與其它植物中BRI1蛋白進(jìn)行同源性分析(圖3)，結(jié)果表明EgrBRI1與擬南芥()、大豆()、蓖麻()、毛果楊()、可可()中的BRI1蛋白同源性高達(dá)77.60%，且都具有保守的3個LRR序列，說明BRI1在植物中高度保守。同時發(fā)現(xiàn)巨桉與楊樹和蓖麻的親緣關(guān)系最近，與其他植物遺傳距離較遠(yuǎn)(圖3)。

2.2 載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位

以克隆載體為模板，經(jīng)過BP反應(yīng)將基因構(gòu)建到入門載體pDONR221中，然后通過LR反應(yīng)將基因構(gòu)建到超表達(dá)載體pMDC32上, 該載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞，菌液PCR檢測證實(shí)基因的超表達(dá)載體已轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株中(圖4)。

亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建同樣使用Gateway克隆法,模板為上一步中的克隆載體, BP反應(yīng)將目的基因交換到入門載體pDONR207上，LR反應(yīng)后將基因構(gòu)建到表達(dá)載體pEarly101中，檢測目的載體是否成功進(jìn)入農(nóng)桿菌GV3101體內(nèi)，使用35S引物和克隆引物(表1)，農(nóng)桿菌菌液PCR檢測，結(jié)果如圖5所示，得到/pEarly101-GV3101菌株, 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建工作完成。

將構(gòu)建好的EgrBRI1亞細(xì)胞定位載體EgrBRI1/ pEarly101-GV3101與pEarly101-GV3101空白載體，利用基因槍法轉(zhuǎn)化進(jìn)入洋蔥表皮細(xì)胞，得到EgrBRI1蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)的瞬時表達(dá)情況。如圖6所示，空白載體轉(zhuǎn)化的洋蔥細(xì)胞內(nèi)熒光分布在細(xì)胞各個部位，而重組載體轉(zhuǎn)化的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)，熒光主要分布在細(xì)胞膜上。這說明EgrBRI1蛋白定位于細(xì)胞膜上進(jìn)一步行使其功能。

2.3 激素處理對EgrBRI1基因的差異表達(dá)影響

從圖7可以看出，經(jīng)過MeJA處理的巨桉葉片中基因的表達(dá)量升高，尤其是在1 h時表達(dá)量急劇升高，約為對照的593倍，說明能夠快速的回應(yīng)MeJA處理(圖7: A)。與MeJA處理相似，BR處理時，基因的表達(dá)量升高，經(jīng)過168 h處理表達(dá)量達(dá)到最高，約為對照的2.9倍(圖7: B)。然而，SA處理時EgrBRI1表達(dá)量并未出現(xiàn)明顯變化(圖7: B)。這說明基因?qū)Σ煌募に仨憫?yīng)方式不同。

2.4 脅迫處理對EgrBRI1基因的差異表達(dá)影響

在鹽處理時，葉片中基因表達(dá)量呈現(xiàn)出先高后低的現(xiàn)象，在6 h處理時表達(dá)量達(dá)到最大，為對照的2.3倍，隨后基因表達(dá)量逐漸降低，在168 h處理時其表達(dá)量顯著下降，遠(yuǎn)低于對照水平(圖8)。而在冷脅迫處理時，基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出快速應(yīng)答的表現(xiàn)，在1 h時表達(dá)量迅速下降，隨后緩慢上升，但仍然低于對照水平，處理48 h表達(dá)量升高，超過對照。這表明基因響應(yīng)鹽脅迫和冷脅迫的表達(dá)方式明顯不同(圖8)。

3 討論

本文成功克隆了巨桉的基因，全長3 893 bp，編碼1 197個氨基酸，與劉明月等[19]克隆的杜仲()基因(無內(nèi)含子,全長為3 612 bp，編碼1 203個氨基酸)長度上存在差異，可能是不同物種的原因。EgrBRI1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)穩(wěn)定，預(yù)測其存在細(xì)胞膜表面，可以感知BR信號，并與之結(jié)合。Wang等[20]報道大豆的GmBRI1蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有激酶活性，且結(jié)構(gòu)高度保守。EgrBRI1蛋白質(zhì)的生物信息預(yù)測結(jié)果與其相似，說明EgrBRI1和GmBRI1蛋白質(zhì)具有親緣性。通過構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化洋蔥細(xì)胞，觀察到EgrBRI1蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞膜上。這說明BRI1蛋白質(zhì)在植物中具有高度的保守性，主要在細(xì)胞膜上響應(yīng)BR并行使功能。

圖2 EgrBRI1 氨基酸序列與其他植物的多重比較分析。Egr: 巨桉; At: 擬南芥; Pp: 桃樹; Gm: 大豆; Pt: 毛果楊; Rc: 蓖麻; Cp: 番木瓜; Tc: 可可。LRRNT_2: 富含亮氨酸重復(fù)N-末端結(jié)構(gòu)域; LRR_1, LRR_8: 富含亮氨酸重復(fù)序列; Pkinase: 亮氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。

Fig. 2Multiple comparation analysis ofamino acid sequenceof EgrBRI1 and other plants. Egr:; At:; Pp:; Gm:; Pt:;Rc:; Cp:; Tc:. LRRNT_2 is Leucine rich repeat N-terminal domain; LRR_1, LRR_8 are Leucine rich repeats; Pkinase is Leucine kinase domain.

圖3 EgrBRI1的系統(tǒng)進(jìn)化樹。Rc: 蓖麻; Gm: 大豆; Cp: 番木瓜; Egr: 巨桉; Tc: 可可; Pt: 毛果楊; At: 擬南芥; Pp: 桃樹。

圖 4 EgrBRI1超表達(dá)載體構(gòu)建檢測

圖5 EgrBRI1亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建檢測

圖6 EgrBRI1在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位。A: BRI1-YFP明場與熒光場疊加; B: BRI1-YFP明場; C: BRI1-YFP熒光場; D: YFP明場與熒光場疊加; E: YFP明場; F: YFP熒光場。

圖7 茉莉酸甲酯(A)、水楊酸(B: SA)、油菜素內(nèi)酯(B: BR)處理后巨桉葉片中EgrBRI1的相對表達(dá)量

圖8 鹽和冷脅迫下巨桉葉片中EgrBRI1的相對表達(dá)量

植物的生長發(fā)育受植物激素的協(xié)同或拮抗作用共同調(diào)節(jié)，BR作為一種甾醇類新型植物激素參與到植物生長發(fā)育過程中，如種子萌發(fā)、開花、結(jié)實(shí)、解除逆境脅迫等。BR與其他植物激素間存在互作，共同調(diào)節(jié)植物的各個生長發(fā)育過程[21]。MeJA處理1 h的表達(dá)量是對照的593倍，表明JA與BR具有協(xié)同作用。張弦等[22]也報道，MeJA和BR處理能減輕強(qiáng)光對蘋果()葉片的抑制作用。同時對水楊酸的刺激沒有明顯的響應(yīng)，然而徐曉昀等[23]的研究卻認(rèn)為，外施水楊酸和BR能增強(qiáng)黃瓜()幼苗對低溫的耐受性。這可能是不同物種的響應(yīng)機(jī)制不同導(dǎo)致的。而外施BR 1 h的表達(dá)量略微降低，隨后表達(dá)量顯著升高，說明在桉樹中作為BR的受體，能夠明顯響應(yīng)BR。但在郝嶺等[24]的研究提到，在玉米中過表達(dá)基因會恢復(fù)突變體的表型, 這是由于修復(fù)了突變體信號通路, Wang等[20]的研究也有相似的結(jié)論，這進(jìn)一步證實(shí)了的表達(dá)受BR的調(diào)控。

同時，本研究結(jié)果還表明能對鹽脅迫和冷脅迫做出應(yīng)答。岳健敏等[25]研究提出，鹽脅迫下外源添加BR能提高刺槐()葉片中葉綠體的數(shù)量，維持一定的光合作用，增強(qiáng)對鹽脅迫的抗性，但并未對BR相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究。而本研究結(jié)果表明，鹽處理6 h的表達(dá)量有明顯上調(diào)，意味著BR對于鹽脅迫的應(yīng)答可能是通過表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。而冷脅迫處理48 h表達(dá)量為對照的1.6倍，表明能夠響應(yīng)冷脅迫。而吳進(jìn)東[26]的研究也提出，BR能夠增強(qiáng)植物抗寒性，主要是通過提高植物葉片抗氧化酶系統(tǒng)的活性。因此，我們推測基因可能通過響應(yīng)BR來提高桉樹的耐寒性，具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。后續(xù)我們將構(gòu)建啟動子載體和超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化桉樹，以期獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株，通過表型分析等進(jìn)一步完善基因的功能鑒定。

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Gene Cloning and Expression Analysis ofin

LI Xiao-dan, HU Bing, QIU Zhen-fei, FAN Chun-jie, YAN Hui-fang, ZENG Bing-shan*

(Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guagndong,Guangzhou 510520, China)

In order to understand the function ofgene in,gene was cloned, and the bioinformatics and subcellular localization of EgrBRI1 were analysis. Meanwhile, the expression ofgene were analyzed after treated with hormones and stresses by qRT-RCR. The results showed that the length ofgene was 3 893 bp, encoding 1 197 amino acids. EgrBRI1 protein was relatively stable with complex spatial structure, which contains three motifs. EgrBRI1 protein was mainly located in cell membrane. When treated with methyl jasmonate and brassinolide, the expression ofgene in leaves showed an up-regulated trend with the time, while there was no significant change by treated with salicylic acid. Under salt and cold stresses, the expression ofgene was down-regulated at first and then increased with the time. These indicated thatgene could respond quickly to applied hormone and play an important role in stress resistance of, which might be achieved by responding to BR signal.

; Brassinosteroid;gene; Gene expression

10.11926/jtsb.4044

2019–01–21

2019–03–12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400554)資助

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31400554).

李曉丹(1995~ )，女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榱帜旧锛夹g(shù)。E-mail: 924489727@qq.com

Corresponding author. E-mail:b.s.zeng@vip.tom.com