Th17/Treg及其相關炎性介質在重癥膿毒癥中的表達機制研究

文明祥 孫鴻鵬 潘渝 梅華鮮 葉八寧 施賢清

（貴州省人民醫(yī)院 貴州 貴陽 550002）

重癥膿毒癥是由感染所引起的全身炎癥反應所引發(fā)的疾病，由于其發(fā)病過程中容易導致患者體內多種炎癥細胞和炎癥介質的產生，繼而誘導炎癥的級聯反應，導致患者易出現各器官功能紊亂和衰竭，嚴重的情況下會產生休克和死亡等惡性臨床事件。在最新的研究指出，重癥膿毒癥是炎癥反應中促炎和抗炎反應相互影響的結果[1]。然而在炎癥反應中，Th17細胞及其相關炎癥介質（IL-6、IL-17）的促炎作用和Treg細胞及其相關炎癥介質（IL-10、TGF-β）的抗炎作用被認為最具有代表性。因此，本文以Th17和Treg細胞及其炎癥介質作為重癥膿毒癥的發(fā)病機制進行研究，為重癥膿毒癥的臨床研究提供依據和參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-10月在我院接受治療的重癥膿毒癥患者35例作為研究組，同時選取健康人群（35例）作為對照組，兩組患者在病程、年齡、男女性別比例、病歷等資料上均無顯著差異。其中準入標準為ACCP（美國胸科醫(yī)師學院）和SCCM（美國危重疾病醫(yī)學會）共識會議制定的診斷標準。其中排除標準：患有哮喘、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病的患者；患者出現休克等意識不全的患者；患有艾滋病、急性冠脈綜合癥、腫瘤、肝炎的患者；患者在住院2個月內使用激素類藥物和免疫抑制類藥物的。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測樣本收集 對研究組和對照組的研究對象全部實施靜脈抽血（5ml）來獲得其外周血的樣本，其中重癥膿毒癥患者必須在確診1h內實施靜脈抽血,并將獲得的血液樣本滴加肝素做抗凝處理后，置于冰箱（-4℃）下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 流式細胞技術檢測Th17與Treg細胞 在每個檢測的樣本中分別取出50ul、100ul分別用于檢測樣本中Th17與Treg細胞的含量。在50 ul血液樣本中添加IL-17APE(EB 公司、5ul)，同時在100 ul血液樣本中添加CD-ECD-CD25-PC5-CD127-PE(EB 公司、10ul)，常溫下避光培養(yǎng)15分鐘，添加紅細胞裂解液，并繼續(xù)避光培養(yǎng)10分鐘后，添加PBS（1.5ml）后離心5分鐘（1500轉/分）去上清（重復一次）。將獲得的產物置于流式細胞儀上檢測Th17和Treg細胞的含量，其中IL-17A+、CD4+、CD3+、CD3射門均為Th17細胞，而CD4+CD25+CD127為Treg細胞。

1.2.3 Th17細胞相關IL-6、IL-17和Treg細胞相關IL-10、TGF-β的檢測 對Th17細胞相關IL-6、IL-17和Treg細胞相關IL-10、TGF-β的檢測應用ELISA法，具體的實驗操作，參照ELISA試劑盒（上海極威生物科技有限公司）的操作指南進行。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17和Treg細胞的含量顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果（）

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果（）

組別 樣本數 Th17（%） Treg（%）研究組 35 5.73±0.31 9.53±0.51對照組 35 2.35±0.26 5.98±0.26

2.2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17/Treg值顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結果（）

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結果（）

組別 樣本數 Th17/Treg研究組 35 0.601±0.062對照組 35 0.393 ±0.029

2.3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達量顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果（）

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果（）

TGF-β（Pg/ml）研究組 35 33.62±8.69 113.52±12.61 39.15±9.26 45.36±9.75對照組 35 11.39±3.95 35.41±7.51 12.33±4.26 18.32±5.11組別 樣本數 IL-6（Pg/ml）IL-17（Pg/ml）IL-10（Pg/ml）

3.討論

在重癥膿毒癥的臨床和發(fā)病機理研究中，炎癥反應是導致其發(fā)生的核心病理變化過程，其中最具有代表性的促炎細胞為Th17細胞，及其相關的促炎因子IL-6、IL-17，而最具有代表性的抗炎細胞為Treg細胞，及其相關的抗炎因子IL-10、TGF-β。國內外專家指出，Th17細胞和Treg細胞的動態(tài)平衡過程是決定重癥膿毒癥病變的核心環(huán)節(jié)，當Th17細胞增多且功能增強時，往往會誘導體內激烈的炎癥反應，從而促進重癥膿毒癥的發(fā)生；而當Treg細胞增多且功能增強時，能導致Th17細胞失活和凋亡，從而抑制炎癥反應的進程，進而標志著重癥膿毒癥得到一定的控制。然而國內外報道中并沒有從患者外周血液的Th17、Treg和其相關炎癥因子的表達變化情況中尋找到直接證據，來充分說明Th17、Treg參與重癥膿毒癥的生物學機制。

因此，本文對Th17和Treg細胞及其炎癥介質作為重癥膿毒癥的發(fā)病機制進行研究。研究結果表明，重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th1和Treg細胞的含量，IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達量、Th17/Treg值都顯著升高（較對照組）。而這一結果也表明了，體內的炎癥反應是重癥膿毒發(fā)病的重要因素之一；Th17/Treg值的升高表明患者體內促炎反應（Th17）明顯強于其抗炎反應（Treg）。