復方體外培育牛黃微乳凝膠的經皮滲透研究*

程璐，黃蕾，劉新國

(武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 430022)

中醫(yī)認為痤瘡主要為熱毒、瘀血所致，治療原則應為清熱解毒、活血祛瘀[1-3]。復方體外培育牛黃微乳凝膠由牛黃、丹皮酚和鹽酸小檗堿等中藥或中藥有效成分組成，用于治療痤瘡，具有清熱解毒、活血祛瘀、抗菌消炎的功效[4]。其中黃連、黃柏為清熱解毒典型代表藥，鹽酸小檗堿為其共有有效成分，且具有較強的抗痤瘡丙酸桿菌作用[5-6]。丹皮酚為具清熱涼血、活血祛瘀功效的牡丹皮中有效成分，也具有較強的抗痤瘡丙酸桿菌作用[7]。然而痤瘡丙酸桿菌主要存在患者毛囊皮脂腺中[8]，不僅要求凝膠基質與皮膚組織有良好親和性，更需要抗菌成分從基質逐步釋放，透入皮膚深層產生作用，因此通過離體皮膚的滲透實驗來評估復方體外培育牛黃微乳凝膠的皮膚滲透能力，篩選合適的制劑藥物劑量水平，并考察各指標成分之間透皮行為的相互影響，可為新制劑開發(fā)奠定研究基礎。

1 實驗材料

1.1儀器 ME 215s型分析天平(賽多利斯公司，感量：0.01 mg)；Essentia LC-16型二元泵高效液相色譜儀(島津公司)；RYJ-12B型藥物透皮擴散實驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；HS6510D型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 丹皮酚對照品、鹽酸小檗堿對照品(批號分別為0708-9704，0713-200911，均購自中國食品藥品檢定研究院)；復方體外培育牛黃微乳凝膠制劑(自制，批號：150901，150910，150922)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)，磷酸(分析純，天津市白世化工有限公司)，其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.3實驗動物 健康成年雄性SD大鼠20只，華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(鄂)2016-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：屏蔽系統(tǒng)，室溫(22±3) ℃，相對濕度(55±5)%。

2 方法與結果

2.1指標成分含量測定方法

2.1.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸(B)(0～7 min，35%A→45%A；7～13 min，45%A→55%A；13～15 min，55%A→35%A)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長為265 nm，進樣量10 μL。

2.1.2對照品貯備溶液 精密稱取減壓干燥至恒重的鹽酸小檗堿和丹皮酚對照品適量，加甲醇分別制成濃度均為500 μg·mL-1對照品貯備溶液。

2.1.3線性關系的考察 精密吸取上述兩種對照品貯備溶液100，200 μL和1，2，4，8 mL，用甲醇稀釋定容至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進行測定。以峰面積積分值為橫坐標(X)，以進樣量(ng)為縱坐標(Y)，進行線性回歸計算，結果鹽酸小檗堿在50 ng～4 μg濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=0.341×10-2X+2.3644，r=1.000 0；丹皮酚在50 ng～4 μg濃度范圍內線性關系良好，回歸方程：Y=0.311 5×10-4X+5.292 6，r=0.999 9。

2.1.4精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復進樣6次，分別測定指標峰峰面積，鹽酸小檗堿和丹皮酚峰面積RSD值分別為1.2%和0.48%，表明儀器精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，6，12，24 h進樣，測定兩個指標峰的峰面積，經計算鹽酸小檗堿和丹皮酚峰面積RSD值分別為0.31%和0.37%，表明供試品溶液在24 h內保持穩(wěn)定。

2.1.6回收率實驗 分別向已知含量的滲透液樣品中加入一定量鹽酸小檗堿和丹皮酚對照品溶液，用流動相定容至10 mL，混勻，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，利用標準曲線計算含量，并計算加樣回收率。結果鹽酸小檗堿和丹皮酚平均加樣回收率分別為98.13%和98.65%，RSD分別為0.80%和0.50%。見表1。

表1 鹽酸小檗堿和丹皮酚加樣回收率計算結果

Tab.1Resultsofrecoverytestonberberinehydrochlorideandpaeonol

稱樣量/g原有量加入量測得量μg回收率/%鹽酸小檗堿5.245 6204.7103.6304.996.725.218 6203.7103.6305.898.555.262 4205.4207.2408.397.925.225 8204.0207.2409.198.985.269 1205.7310.8511.798.465.236 4204.4310.8509.598.17丹皮酚2.524 9342.3206.8546.698.792.091 8343.4206.8545.797.822.245 6342.4310.2648.198.542.267 3352.0310.2654.397.452.256 4342.5620.4958.599.292.315 8330.0620.4946.398.34

2.2不同體外牛黃濃度復方微乳凝膠經皮滲透實驗

2.2.1實驗皮膚的制備 雄性SD大鼠20只，8%BaS腹部脫毛，飼養(yǎng)24 h，處死后取下腹部皮膚，仔細剝離皮下脂肪組織，并用0.9%氯化鈉溶液沖洗至無渾濁為止。處理好的皮膚可用鋁箔包裹，置于-20 ℃低溫冰箱中保存，備用。

2.2.2試藥制備 精密稱取處方量丹皮酚、桉油精，山梨醇甘油酸酯和聚山梨醇-80，45 ℃水浴加熱溶于液體石蠟中，攪拌均勻為油相。另稱取處方量鹽酸小檗堿溶于熱水中，攪拌均勻為水相，在45 ℃水浴加熱條件下，將水相慢慢加入油相，同時磁力攪拌，制成初乳，將初乳在超聲功率450 W，超聲時間與間歇時間比為2：1，超聲總時間為5 min的條件下進行超聲乳化，備用。稱取卡波姆940撒入適量雙蒸水中，靜置過夜，待其溶脹均勻后加入處方量甘油和適量三乙醇胺，攪勻。取制備好的乳劑5 g，加入體外培育牛黃(微粉至篩孔內徑0.0750 mm)1 g，研勻，加入適量空白凝膠基質中，攪勻。防腐劑山梨酸鉀用適量純化水溶解，用量為2.0‰，加入上述制備好的凝膠中，加純化水定量至100 g，即得。按上述方法另制備含量分別為處方量20%，50%，75%，200% 4種不同藥物濃度的微乳凝膠以及鹽酸小檗堿、丹皮酚單一成分微乳凝膠[7]。

2.2.3經皮滲透實驗方法 取預處理的鼠皮，將不同藥物濃度復方體外培育牛黃微乳凝膠分別均勻涂抹于離體鼠皮角質層一側，用改良的Franz擴散池(池口面積為2.8 cm2，體積6.5 mL)的兩個半池將皮膚夾緊，角質層面向上，將多余的皮膚剪去，固定裝置。將20%乙醇和0.9%氯化鈉溶液加入接收池，液面與皮膚內層接觸，保證無氣泡存在。開動電磁攪拌器恒速攪拌(200 r·min-1)和恒溫水浴(32±1) ℃。另取一套Franz裝置，同法操作，將不含藥物的空白基質緊貼于離體鼠皮角質層一側，作為空白對照。分別于規(guī)定時間取樣5 mL，再立即補充相同溫度5 mL接收液。接收液用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液供HPLC測定。對照品溶液、樣品溶液、空白基質液進樣檢測的HPLC色譜圖，結果表明空白基質及皮膚不干擾測定。

在測定的峰面積標準曲線上求出相應的藥物濃度，計算累積滲透量[Q，μg·(cm2)-1]，擬合Q～t經時變化曲線，結果見圖1。

以Q～t作線性回歸，直線的斜率即為透皮速率[J，μg·(cm2·h)-1]，將穩(wěn)態(tài)直線推至時間軸，得滲透時滯tlag(h)。

式中，Cn：第n個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1)；Ci：第i(i=n-1)個取樣點測得的藥物濃度(μg·mL-1)；A：有效擴散面積。

對累積釋藥量Q[μg·(cm2)-1]進行零級、一級和Higuchi動力學方程擬合，得下列方程見表2。結果顯示，在考察藥物濃度范圍復方體外培育牛黃微乳凝膠中鹽酸小檗堿成分經皮滲透參數(shù)均以零級動力學方程擬合為優(yōu)，表明該成分透過皮膚是一個被動擴散過程，單位時間透皮量與基質藥物濃度呈正比，且Q-t關系可用Ficks擴散定律來描述。而丹皮酚成分經皮滲透參數(shù)則均以Higuchi動力學方程擬合為優(yōu)，表明在此濃度范圍內丹皮酚從凝膠基質骨架中釋放量遵循單位面積釋放量與時間的平方根成正比的規(guī)律，基質藥物濃度增加與單位時間透皮量提高不呈比例。見表2。

A.接收液中鹽酸小檗堿；B.接收液中丹皮酚

Fig.1Time-dependentcurveofaccumulatedtransdermalpermeationstudyoncompoundcultivatedcalculusbovismicroemulsiongelinvitroatdifferentconcentration

2.3單一成分與復方成分透皮行為的比較 為考察復方體外培育牛黃微乳凝膠中成分單用與合用對透皮行為的影響，制備鹽酸小檗堿、丹皮酚單一成分微乳凝膠，并按照“2.2.3”項下方法進行透皮實驗，每種藥物平行操作6次，并對接收液中鹽酸小檗堿和丹皮酚含量進行測定。結果顯示，鹽酸小檗堿單一成分制劑16 h內累積透皮量顯著大于復方制劑(P<0.05)，而丹皮酚單一成分制劑與復方制劑在考察時間內累積透皮量差異較小，這說明復方體外培育牛黃微乳凝膠中可能存在影響鹽酸小檗堿釋放或透皮的不利因素，還需要深入研究，找出原因并加以克服。見圖2，表3。

表2 復方體外培育牛黃微乳凝膠中鹽酸小檗堿和丹皮酚經皮滲透動力學參數(shù)

Tab.2Transdermalpermeationparametersofberberinehydrochlorideandpaeonolincompoundcultivatedcalculusbovismicroemulsiongelinvitron=6

名稱與方程類型鹽酸小檗堿透皮量-時間擬合方程相關度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]時滯時間/h丹皮酚透皮量-時間擬合方程相關度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]時滯時間/h25%藥物濃度 ZeroQ=23.10t-4.4960.991 223.100.19Q=6.45t+15.770.972 96.45- FirstlnQ=0.274 9t+2.479 20.822 40.2749-lnQ=0.183 3t+2.4830.719 30.183 3- HiguchiQ=93.48t1/2-66.660.949 693.480.71Q=27.93t1/2-5.3500.996 927.930.1950%藥物濃度 ZeroQ=36.58t-9.9610.988 436.580.27Q=7.99t+17.140.974 47.99- FirstlnQ=0.284 2t+2.828 80.802 70.284 2-lnQ=0.193 2t+2.565 20.724 10.193 2- HiguchiQ=147.25t1/2-106.740.941 7147.250.72Q=34.41t1/2-8.6760.993 934.410.2575%藥物濃度 ZeroQ=56.31t-15.560.986 456.310.27Q=9.37t+17.5360.979 79.37- FirstlnQ=0.298 3t+3.115 30.788 20.298 3-lnQ=0.201 0t+2.618 30.730 00.201- HiguchiQ=227.28t1/2-165.810.942 4227.280.72Q=40.12t1/2-12.2150.992 740.120.30100%藥物濃度 ZeroQ=65.28t-20.940.994 565.280.32Q=9.75t+16.0490.983 79.75- FirstlnQ=0.308 8t+3.152 50.791 80.308 8-lnQ=0.203 4t+2.607 00.737 60.203 4- HiguchiQ=263.52t1/2 -195.210.950 3263.520.74Q=41.414t1/2-14.2110.988 641.4140.34200%藥物濃度 ZeroQ=110.16t-53.270.988 5110.160.48Q=14.69t+20.310.983 414.69- FirstlnQ=0.318 3t+3.545 50.774 00.318 3-lnQ=0.220 9t+2.809 90.735 70.220 9- HiguchiQ=439.44t1/2 -336.480.933 4439.440.76Q=62.25t1/2-25.0270.986 762.250.40

A.接收液中鹽酸小檗堿；B.接收液中丹皮酚

Fig.2Time-dependentcurveofaccumulatedtransdermalpermeationstudyonberberinehydrochlorideandpaeonolascompoundorsinglecomponent

表3 復方和單一成分鹽酸小檗堿與丹皮酚的經皮滲透動力學參數(shù)

Tab.3Transdermalpermeationparametersofberberinehydrochlorideandpaeonolascompoundorsinglecomponentn=6

對象與方程類型透皮量-時間擬合方程相關度透皮速率/[μg·(cm2)-1·h-1]時滯時間/h鹽酸小檗堿(單一成分) ZeroQ=109.38t+71.5920.992 6109.38- FirstlnQ=0.290 0t+4.106 40.798 60.29- HiguchiQ=455.12t1/2-248.550.941 9455.120.55鹽酸小檗堿(復方) ZeroQ=59.70t-26.0490.978 059.700.43 FirstlnQ=0.304 6t+3.081 20.716 90.30- HiguchiQ=239.33t1/2 -181.970.994 5239.330.76丹皮酚(單一成分) ZeroQ=9.987t+20.4460.988 39.987- FirstlnQ=0.200 4t+2.706 50.749 90.20- HiguchiQ=42.903t1/2-11.5680.982 242.9030.27丹皮酚(復方) ZeroQ=11.52t+14.4820.988 311.52- FirstlnQ=0.213 3t+2.626 10.749 90.21- HiguchiQ=48.361t1/2-20.1270.982 248.3610.42

3 討論

由于細菌感染與炎癥反應是痤瘡發(fā)病的兩個主要因素，將具清熱解毒、活血化瘀功能且具有抗菌活性和(或)抗炎活性的中藥和(或)其有效成分，組成復方制劑，其目的是為了既抗炎又抗菌，起協(xié)同作用，從理論上講療效應比單純應用某一種好，而且誘導耐藥性的可能性極小[9]。將選定的中藥或中藥有效成分物組成不同處方和(或)比例，切合現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)病機制，通過體外模擬實驗多角度證實有效成分透皮性能，探討透皮過程成分間相互影響，并篩選合適的基質藥物濃度，為探究新劑型經皮滲透特征、臨床使用和優(yōu)化處方組成提供實驗依據。