RP-HPLC法測定鹽膚木中樺木酸和樺木醇含量的方法

王玉祝，余 洋，高 靜*，王 剛

(1.江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 上海市第八人民醫(yī)院藥劑科，上海 200235)

鹽膚木(RhuschinensisMill)為漆樹科鹽膚木屬植物，別名五倍子樹，為中藥大辭典收載的傳統(tǒng)中藥[1]。在我國部分地區(qū)作為治療癌癥的中草藥[1]。蚜蟲寄生在鹽膚木葉上后可以刺激葉組織細胞增生，形成蟲癭，成為五倍子[2]。以根、葉入藥，有清熱解毒、散瘀止血之功效[3]，主治支氣管炎，咳嗽咯血，腸炎，痢疾。已知鹽膚木含有黃酮類[4-6]、酚酸類[5-9]、鞣質(zhì)[6]、脂肪酸[7]和三萜類[5, 6, 8]等成分，有抗病毒，抗菌，抗氧化，抗腫瘤等作用[10-14]，本課題組對鹽膚木根莖進行有效成分研究時發(fā)現(xiàn)鹽膚木根莖富含三萜酸。本實驗采用RP-HPLC法，對其中明確的兩種三萜酸-樺木酸、樺木醇進行了測定。本研究建立了分離效果好、專屬性強的高效液相色譜法測定其中的兩種三萜酸的方法，結(jié)果滿意，可作為鹽膚木根莖中三萜酸質(zhì)量控制的指標之一。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺木酸(Betulinic acid，98%)、樺木醇(Betulin，98%)購于上海歆睿有限公司；乙腈和甲醇(色譜純，美國TEDIA公司)，水為自制重蒸餾水；其它為分析純；鹽膚木根莖購自同仁堂藥房，經(jīng)江蘇大學(xué)楊歡教授鑒定為鹽膚木(R.ChinensisMill)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)； AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DL-720A超聲清洗儀(上海市之信儀器有限公司)；RE-53AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德實驗儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Hypersil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水-磷酸(89:10:1)；柱溫:室溫;進樣量: 20 μL；體積流量: 0.8 mL·min-1；靈敏度: 1.00 AUFS；檢測波長: 205 nm。

在上述色譜條件下，對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 對照品和鹽膚木樣品的HPLC圖Fig 1. HPLC chromatogram of reference substance and R. Chinensis Mill sample注：A.對照品 B.鹽膚木樣品 1. 樺木酸 2.樺木醇

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品樺木醇5.22 mg、樺木酸5.46 mg，以流動相定容至100 mL作為對照品儲備液，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

將鹽膚木粉碎過80目篩，用乙醇回流提取，控制溫度，加熱提取5 h后超聲1 h，抽濾，然后50℃減壓濃縮濾液，重復(fù)2次，合并濃縮液。濃縮液分別用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇進行萃取。二氯甲烷萃取部分300～400目硅膠拌樣，干燥后，采用濕法裝柱，從二氯甲烷：甲醇50∶1開始進行梯度洗脫，15∶1部分得到樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺木酸、樺木醇提取工藝的考察

影響樺木酸、樺木醇提取率的主要因素：料液比(A)、乙醇濃度(B)以及提取溫度(C)，試驗因素水平安排見表1。結(jié)合文獻和預(yù)實驗結(jié)果，以上述3個因素為主要考察因素，每個因素設(shè)立3個水平，采用L9(34)正交設(shè)計，以鹽膚木提取物中的樺木酸、樺木醇含量為指標進行綜合加權(quán)評分，按下列公式進行計算：綜合得分=樺木酸含量得分×50%+樺木醇含量得分×50%，考察各因素對提取效率的影響，優(yōu)選樺木酸、樺木醇的提取工藝，試驗結(jié)果見表2。 因素A、C對樺木酸、樺木醇的提取有顯著性影響，通過方差比較可以影響提取效果的主次因素依次是A>C>B，可以得到A2B1C2為最優(yōu)的組成及工藝，即: 采用料液比為1∶20(1 g藥材加入20 mL乙醇)，乙醇濃度為60%，提取溫度為50℃為最佳工藝。

表1 試驗因素水平表

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果及綜合評分

表3 試驗方差分析表

注：*差異顯著，P<0.05。

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2中對照品儲備液1、3、5、7、10 mL，分別用流動相定容至10 mL容量瓶中，搖勻。分別精密吸取上述標準系列溶液20 μL。在上述色譜條件下測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標，進行線性回歸，樺木酸、樺木醇的線性回歸方程依次為：Y=57487X+38647、Y=64932X+45671 ，線性范圍分別為5.2～52 μg·mL-1、10.8～108 μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)分別為0.9996，0.9995。

2.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20 μL，重復(fù)進樣5次，以峰面積計算，樺木酸、樺木醇的RSD分別為1.6%、0.9%(n=5)。

2.4 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次鹽膚木樣品5份，每份約10 g，按2.3項方法進行操作，制得5份供試品試液。按2.1色譜條件分別進樣，樣品中含有樺木酸、樺木醇的量分別為0.014%、0.106% (n=5)，RSD為0.6%、0.9%(n=5)。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批次供試品溶液，按2.1色譜條件，分別在1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 h進樣，測定各成分的質(zhì)量分數(shù)，樣品中樺木酸、樺木醇的RSD分別為1.2%、0.9%(n=5)。說明3成分的乙醇溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗

精密量取已知含量鹽膚木5份，每份1 g。向每份樣品分別加入樺木酸、樺木醇標準品各2 mg。按2.3項方法進行操作，最后將提取粉末用甲醇定容至10 mL容量瓶中，制得5份加標溶液，分別進樣20 uL，結(jié)果得到樺木酸、樺木醇的平均回收率分別為99.3%、99.0%，RSD分別為0.8%、1.0%。

2.7 樣品測定

精密吸取供試品溶液20 μL注入HPLC儀，重復(fù)進樣3次，記錄色譜圖按外標法以峰面積計算，測定制備的鹽膚木樣品，樣品中3成分結(jié)果見表4。

表4 鹽膚木樣品中樺木酸和樺木醇的測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 萃取試劑的選擇

樺木酸、樺木醇為五環(huán)三萜類化合物，用乙醇回流方法進行粗提后采用正丁醇、乙酸乙酯、石油醚萃取，其中以石油醚部位含量最高，故最終采用石油醚萃取。

3.2 檢測波長的選擇

分別取樺木酸、樺木醇對照品溶液，在紫外分光光度計上進行掃描,各對照品均在205 nm處有最大吸收，在其他波長處無吸收，因此選205 nm作為檢測波長。

3.3 色譜條件的選擇

取樺木酸、樺木醇兩種對照品混合溶液，進樣分析。色譜柱采用Hypersil- C18柱(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)，根據(jù)參考文獻[15]，采用甲醇-水系統(tǒng)為流動相時，樣品不能完全分離，且由于甲醇末端吸收較強，基線不平穩(wěn)；之后采用乙腈-水系統(tǒng)，分離度很好，加入0.1%磷酸后峰形有所改善。因此最終采用乙腈-水-磷酸(89∶11∶0.1)為流動相。由于預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)室溫下三萜類成分出峰時間較靠前，設(shè)置流速為0.8 mL·min-1后，出峰時間后移，且雜質(zhì)減少，因此，最終采取實驗方案所選擇的色譜條件。

鹽膚木三萜部分具有明顯的藥理活性。本實驗通過對鹽膚木中兩種三萜酸的測定，可作為鹽膚木質(zhì)控指標。