生物抗菌多肽在換牙期兒童專用牙膏中的應(yīng)用

許 亮，汪明新，賈源賓

(南京映海月生物科技有限公司，江蘇 南京 210014)

齲齒涉及牙齒結(jié)構(gòu)、牙齒表面形成的微生物生物膜和糖類之間的相互作用，以及唾液和遺傳影響[1]。多樣性的口腔細(xì)菌被基質(zhì)包裹附于牙齒表面，形成一層牙菌斑生物膜[2]。病原菌定值在牙齒表面形成的細(xì)菌生物膜并且分泌破壞牙齒微環(huán)境的物質(zhì)，如產(chǎn)酸影響口腔pH是齲齒的主要原因[3,4]。

幼兒齲齒(ECC)是一種非常嚴(yán)重且最常見的慢性兒童期疾病，是一種由細(xì)菌介導(dǎo)的多因素疾病，其特征是≤6歲兒童的牙齒明顯腐爛，并且近年來全球2至5歲兒童的齲齒患病率有所增加[5,6]。每天使用含氟牙膏刷牙對防齲有一定的作用[7]，但其對嚴(yán)重的口腔問題例如口腔潰瘍、牙周炎等作用效果一般。一款適合的換牙期兒童專用牙膏對兒童的健康至關(guān)重要?，F(xiàn)有具有殺菌功能的牙膏，有的添加抗生素、消毒劑，如三氯生、洗必泰等，將有害菌、有益菌全部殺死，破壞了口腔微生態(tài)環(huán)境，增加了細(xì)菌的抗藥性。因此亟待開發(fā)出對口腔病原菌及進(jìn)食過程中殘留在口腔的外界病原菌有殺滅作用且能夠促進(jìn)口腔粘膜的修復(fù)和防御的新型牙膏，對換牙期兒童的健康非常重要。

大多數(shù)抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，且不容易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，除此之外一些抗菌肽還具有免疫調(diào)節(jié)作用，近年來抗菌肽在抗口腔病原微生物的應(yīng)用方面成為研究熱點[8,9,10]。因此，也可以考慮將抗菌肽加入牙膏用于日常防齲齒?？咕腃bf-14(RLLRKFFRKLKKSV)及Cbf-K16(KFFRKLKKSVKKRAKKFFKKPRVIDVSIPF)是基于天然金環(huán)蛇毒素中提取并分離得到的BF-30(KFFRKLKKSVKKRAKEF FKKPRVIGVSIPF) 經(jīng)結(jié)構(gòu)改造、優(yōu)化獲得的小分子多肽，前期研究表明這三種多肽在體內(nèi)外均具有廣譜抗菌活性，且不容易產(chǎn)生耐藥問題[11,12,13]。Magainin是由非洲爪蟾皮膚中提取的一類陽離子抗菌肽，MSI-78是源于Magainin 2的一種衍生肽，具有廣譜抗菌效果，并曾經(jīng)用于臨床糖尿病足部潰爛的治療[14]，MSI-1(GIWKFLKKAKKFWK)抗菌肽由MSI-78結(jié)構(gòu)優(yōu)化而來，活性及毒性均有所改善。

本研究主要比較了在換牙期兒童專用牙膏中應(yīng)用的幾種抗菌肽的體外抗菌效果。即測定MSI-1、Cbf-14、BF-30和Cbf-K16對臨床常見金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、口腔齲齒和牙周炎主要病原菌變異鏈球菌，及口腔益生菌嗜酸乳桿菌的最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)；通過濾紙片法檢測生物抗菌多肽牙膏對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變異鏈球菌的殺菌效果；通過殺菌曲線(KCs)測定幾種多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異鏈球菌的殺菌效果，從而反映生物抗菌多肽牙膏的抗菌效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物抗菌多肽牙膏主要成分為抗菌肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16，白芨提取物Bletilla striata，柔性水合硅石，木糖醇，山梨糖醇，甘油，月桂醇硫酸酯鈉，纖維素膠，薄荷糖，維生素C，食品級草莓香精，純化水。

阿莫西林膠囊(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；甲硝唑(生物工程(上海)股份有限公司，純度 > 98%)；抗菌肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16(吉爾生化(上海)有限公司合成、純化，純度 > 98%)；厭氧袋(三菱集團(tuán)Mitsubishi Group)。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基；Mueller-Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基；Mueller- Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基，均由北京三藥科技開發(fā)公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC 25923；大腸桿菌(Escherichiacoli) ATCC 25922；變異鏈球菌(Streptococcusmutans) UA140。臨床株：金黃色葡萄球菌3株，大腸桿菌3株，均由東南大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科臨床分離鑒定并提供。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平(CP64)，奧豪斯儀器(上海)有限公司；超凈工作臺(MSC-Advantage 1.8)，美國Thermo Forma公司；高壓滅菌鍋(MLS-3781L)，HIRYAMA公司；752紫外可見分光光度計(752N)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9160)，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9076 MBE)，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

取-70℃保存的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株，傳代于營養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，用MH肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋成1 × 105CFU/ml左右的菌懸液備用。取-70℃保存的變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株，傳代于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)16 h后，轉(zhuǎn)接至腦心浸液肉湯培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h，用腦心浸液肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋成1×105CFU/ml左右的菌懸液備用。

1.3.2 多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變異鏈球菌及嗜酸乳桿菌的MIC/MBC測定

采用微量培養(yǎng)基稀釋法測定多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16對細(xì)菌的MIC值[15]。準(zhǔn)確配制濃度為1024 μg/ml的多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16及陽性對照藥阿莫西林及甲硝唑，無菌條件下0.22 μm濾器過濾，用無菌MH肉湯培養(yǎng)基或腦心浸液肉湯培養(yǎng)基將各藥品倍比稀釋為512，256，128，64，32，16，8，4，2，1 μg/ml的溶液，取不同濃度的藥液75 μl至96孔板，同時接種75 μl的1×105CFU/ml相應(yīng)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或變異鏈球菌，使各藥物終濃度為256，128，64，32，16，8，4，2，1，0.5 μg/ml。同時設(shè)置75 μl培養(yǎng)基加75 μl的1×105CFU/ml菌液作陽性對照組，150 μl的培養(yǎng)基作為不含藥液和菌液的空白對照。將含金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的96孔板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，含變異鏈球菌的37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)18 h，酶標(biāo)儀測定OD600，藥物能夠抑制細(xì)菌生長的最低濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

依次從上述未見細(xì)菌生長的96孔板中吸取100 μl培養(yǎng)液，加入無菌平皿中，傾倒恒溫56℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基10 ml，混勻，凝固后于37℃倒置培養(yǎng)或厭氧培養(yǎng)24 h，觀察并記錄各平板上的菌落數(shù)，菌落數(shù)小于5的最低濃度即為相應(yīng)藥物的MBC。

1.3.3 多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異鏈球菌的殺菌曲線測定

用MH肉湯培養(yǎng)基或腦心浸液肉湯培養(yǎng)基將各試驗菌液配制成1×105CFU/ml的菌懸液，吸取5 ml加入到無菌試管中，加入多肽MSI-1，Cbf-14，BF-30，Cbf-K16及陽性藥阿莫西林及甲硝唑使各藥物終濃度為4 × MIC，在0 h，0.5 h，1 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h向試管中吸取200 μl培養(yǎng)物進(jìn)行梯度稀釋及活菌計數(shù)，每個時間點設(shè)置三個平行對照。以細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的對數(shù)值(lg)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制多肽對各細(xì)菌的殺菌曲線。

1.3.4 生物抗菌多肽牙膏對細(xì)菌的抑菌活性測定

制備生物抗菌多肽牙膏含藥紙片，含藥量為10 μg，晾干，備用。采用MH肉湯培養(yǎng)基或腦心浸液肉湯培養(yǎng)基將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變異鏈球菌稀釋為1×107CFU/ml的菌懸液，取1 ml加入到無菌平皿中，隨即加入恒溫45℃的MH瓊脂培養(yǎng)基或腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，將制備好的含藥紙片放置到培養(yǎng)基表面，并設(shè)置含生理鹽水的紙片為陰性對照，將含金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的平皿置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 ～ 24 h，含變異鏈球菌的平皿37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)18 ～ 24 h，觀察抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異鏈球菌的MIC/MBC

結(jié)果如表1所示，多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及變異鏈球菌均具有良好的抑菌活性，尤其Cbf-14對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株MIC值低至4 μg/ml，對變異鏈球菌MIC值為8 μg/ml。多肽MSI-1對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及變異鏈球菌MIC值低至4 μg/ml。多肽對革蘭氏陽性菌的抑菌效果明顯優(yōu)于陽性藥阿莫西林，對大腸桿菌的抑菌效果稍差于阿莫西林。多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16對口腔益生菌嗜酸乳桿菌基本沒有抗菌活性。表2顯示的是多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及Cbf-K16對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、變異鏈球菌及嗜酸乳桿菌的MBC。多肽MSI-1對大腸桿菌殺菌效果最好，MBC為8 μg/ml，與阿莫西林對大腸桿菌的MBC相當(dāng)。甲硝唑?qū)ψ儺愭溓蚓腗BC強于四種多肽，但其只對變異鏈球菌效果較好。同樣多肽MSI-1及Cbf-14對嗜酸乳桿菌也沒有殺菌效果。

表1 多肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16及阿莫西林、甲硝唑?qū)?xì)菌的MIC值Table l MIC of MSI-1, Cbf-14, BF-30 and Cbf-K16,Amoxycillin and Metronidazole against bacteria

表2 多肽MSI-1、Cbf-14、BF-30、Cbf-K16及阿莫西林、甲硝唑?qū)?xì)菌的MBC值Table 2 MBC of MSI-1, Cbf-14, BF-30 and Cbf-K16, Amoxycillin and Metronidazole against bacteria

2.2 多肽對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異鏈球菌的殺菌速率

測定多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30及陽性藥阿莫西林或甲硝唑?qū)瘘S色葡萄球菌、大腸桿菌及變異鏈球菌的殺滅能力。從圖1A可以看出4 × MIC的多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30對金黃色葡萄球菌具有較強的殺滅能力，其中BF-30在1 h之內(nèi)便可全部殺滅細(xì)菌。MSI-1能夠在2 h內(nèi)殺滅全部金黃色葡萄球菌，Cbf-14能夠在4 h內(nèi)殺滅所有細(xì)菌。圖1B顯示的是4 × MIC的多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30對大腸桿菌的殺滅能力。同樣三種多肽對大腸桿菌均具有較好的殺菌能力，其中BF-30對大腸桿菌的殺滅效果最好，2 h內(nèi)殺滅完所有大腸桿菌，MSI-1和Cbf-14在4 h之內(nèi)便可殺滅所有大腸桿菌。圖1C顯示的是Cbf-14、MSI-1、BF-30對引起齲齒的主要病原菌變異鏈球菌的殺菌曲線，結(jié)果顯示這三種多肽對變異鏈球菌也具有良好的殺菌效果，BF-30殺菌效果稍弱于甲硝唑，Cbf-14殺菌效果與甲硝唑相當(dāng)，MSI-1優(yōu)于甲硝唑。

圖1 多肽MSI-1、Cbf-14及BF-30對細(xì)菌的殺菌曲線(A)對金黃色葡萄球菌的KCs；(B)對大腸桿菌的KCs；(C)對變異鏈球菌的KCsFig. 1 The time-kill curves of MSI-1 Cbf-14 and BF-30 against (a) S.aureus,(b) E.coli,(c) S.mutans.

2.3 生物抗菌多肽牙膏對細(xì)菌的抑菌活性

利用濾紙片擴(kuò)散法檢測生物抗菌多肽牙膏對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異鏈球菌的抗菌效果。圖2 A顯示的是含藥紙片對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌效果；圖2 B是含藥紙片在大腸桿菌ATCC 25922平皿上的抑菌圈；圖2 A，B平皿上1，2均為含生物抗菌多肽的濾紙片，3，4濾紙片為生理鹽水，跟陰性對照即生理鹽水對照組相比含藥紙片在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平皿上顯示出明顯的抑菌圈。圖2 C(1，2為含生物抗菌多肽濾紙片，3為生理鹽水濾紙片)為含藥紙片在變異鏈球菌UA140平皿上的抑菌效果。同樣也出現(xiàn)明顯的抑菌圈。生物抗菌多肽對變異鏈球菌的效果略遜于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。結(jié)果說明，含抗菌多肽Cbf-14、MSI-1、BF-30的新型生物牙膏對口腔的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌及引起齲齒的主要病原菌變異鏈球菌均具有一定的抑制效果，即可一定程度上減少口腔炎癥及牙菌斑的形成，利于營造一個健康的口腔環(huán)境。

圖2 生物抗菌多肽牙膏對細(xì)菌的抑菌活性1, 2為生物抗菌多肽牙膏濾紙片；3, 4為生理鹽水對照濾紙片。(A)對金黃色葡萄球菌的抑菌圈；(B)對大腸桿菌的抑菌圈；(C)對變異鏈球菌的抑菌圈。Fig. 2 Antibacterial activity of toothpaste. (a) Antibacterial activity of toothpaste against S.aureus, (b) Antibacterial activity of toothpaste against E.coli, (c) Antibacterial activity of toothpaste against S.mutans.

3 結(jié)論與討論

本文研究了生物抗菌多肽牙膏中的抗菌肽成分對常見幾種與口腔亞健康相關(guān)細(xì)菌的抗菌效果。多肽MSI-1及BF-30對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的ATCC標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株均表現(xiàn)出良好的抗菌活性，多肽MSI-1對大腸桿菌ATCC 25922及變異鏈球菌UA140效果最好；Cbf-14對金黃色葡萄球菌ATCC 25923效果最好。幾種多肽對口腔致病菌均具有良好的抗菌活性，且對口腔益生菌嗜酸乳桿菌基本沒有抗菌活性，即說明生物抗菌多肽牙膏的使用對口腔正常菌群的影響較小。

BF-30對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的殺菌效果， 在1 h之內(nèi)即能快速殺滅所有金黃色葡萄球菌，在2 h內(nèi)殺滅所有大腸桿菌。MSI-1對變異鏈球菌的殺菌效果最好，2 h內(nèi)完全殺滅。濾紙片擴(kuò)散試驗中含藥組出現(xiàn)明顯的抑菌圈，即說明該牙膏能夠在日常使用中能夠一定程度上控制并預(yù)防口腔齲齒、牙周炎及口腔潰瘍的發(fā)生。

近年來發(fā)現(xiàn)口腔衛(wèi)生不良、牙周炎可能會增加口腔菌血癥及細(xì)菌性心內(nèi)膜炎這些系統(tǒng)性疾病發(fā)生的風(fēng)險。所以口腔疾病的日常防治工作尤其重要。生物抗菌多肽對口腔致齲菌的發(fā)生發(fā)展過程都會發(fā)揮作用，因此日常使用生物抗菌多肽牙膏可用于增強機體的抗齲能力。生物抗菌多肽在抗菌的同時，對口腔炎癥也有一定的緩解作用[16]。生物抗菌多肽牙膏在兒童換牙期使用有助于減少兒童口腔齲齒的發(fā)生，具有廣闊的應(yīng)用前景。