高效液相色譜法測定山苓健胃顆粒中甘草酸的含量

唐棣，金明露，葛榮，賀超

(四川省獸藥監(jiān)察所，成都 610041)

山苓健胃顆粒是運用中獸醫(yī)傳統(tǒng)理論研制的中獸藥三類新藥，處方由山楂、茯苓、甘草等藥材組成，采用提取精制的方法制成中藥顆粒劑，具有開胃消滯、健脾除濕之效，用于防治仔豬積滯，脾運失常的脾胃病。經(jīng)反復(fù)試驗研究并查找文獻資料，證實處方中甘草除具有益氣和中的功效外，還具有對脾虛癥的治療作用，其原理是通過使腸上皮細胞的增值凋亡、黏膜的保護修復(fù)達到治愈脾虛狀態(tài)下的胃腸黏膜組織出現(xiàn)的病理性損傷[1]。本試驗擬建立山苓健胃顆粒中甘草的含量測定方法以控制山苓健胃顆粒的質(zhì)量，為了更準(zhǔn)確的反映甘草調(diào)和補脾益氣和胃的主要藥理活性成分，研究建立了采用反相高效液相法測定山苓健胃顆粒中甘草酸含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1100型高效液相色譜儀，島津LC20高效液相色譜儀；色譜柱AgilentXDB-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)，Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；電子天平(型號BP211D)購自德國塞托里斯公司。

1.2 試藥與試劑 甘草酸銨對照品(批號為110731-201619，標(biāo)示含量為93.0%)來源于中國食品藥品檢定研究院；山苓健胃顆粒樣品(每1 g相當(dāng)于原生藥3.461 g)三批，批號分別為20140609、20140610、20140611，來源于XX動物保健科技有限公司；甲醇(色譜純，Thermo fisher公司，批號：201505026)；冰醋酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動相：甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸(65∶35∶1)；流速：1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加流動相制成每1 mL含甘草酸銨16 μg(相當(dāng)于甘草酸15.67 μg)的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細的粉末0.70 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相約45 mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，加流動相至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方及制法制備不含甘草的陰性制劑，取陰性制劑，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗 精密量取上述對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項色譜條件測定，結(jié)果理論塔板數(shù)以甘草酸峰計算為9298，在供試品色譜圖中甘草酸峰與相鄰峰分離良好，分離度為2.92，陰性對照色譜在與對照品色譜相同保留時間處無干擾峰(圖1)。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性滿足檢測要求；處方中其他成分對甘草酸定量檢測無干擾，專屬性能滿足檢測要求。

圖1 專屬性試驗色譜圖(A、B、C分別為甘草酸對照品、 山苓健胃顆粒樣品、缺甘草陰性樣品)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test (A: glycyrrhizic acid B: the sample C: licorice negative control)

2.4 線性關(guān)系考察 取甘草酸銨對照品貯備液(相當(dāng)于甘草酸濃度0.3274 mg/mL)，精密量取1、1、3、5、1、3 mL，分別置100、50、100、100、10、20 mL量瓶中，分別加流動相至刻度，搖勻，制備的對照品溶液濃度分別為3.274、6.548、9.822、16.37、32.74、49.11 μg/mL。按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，進行線性回歸，得回歸方程Y=8.3005X-6.5611，r=0.9996(n=6)，甘草酸在3.274～49.11 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收的方法，在已知含量的山苓健胃顆粒中，加入一定質(zhì)量的甘草酸銨對照品，按供試品溶液制備方法制備，使其制備后在供試品中的量為其限度值的80%、100%和120%，共制備9份。再按2.1項色譜條件測定峰面積，計算甘草酸的量，用實測值與供試品中含量之差，除以加入對照品量，計算甘草酸回收率，即得?；厥章蔙(100%)=(實測量-供試品中含有量)/添加量×100%，測定結(jié)果表明，甘草酸的回收率在98.2%～102.6%之間，平均回收率為99.9%，RSD為1.30%，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗Tab 1 Recovries of glycyrrhizic acid in preparation

2.6 精密度 取供試品(批號為20140609)溶液，精密量取20 μL，按2.1項色譜條件重復(fù)進樣6次，測得甘草酸峰面積RSD為1.30%，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗Tab 2 Precision test

2.7 耐用性 取同一批山苓健胃顆粒(批號為20140609)樣品，按2.2項下方法制成供試品溶液，保持流動相比例和流速不變，在島津LC20高效液相色譜儀和Agilent1100色譜儀上分別使用Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)和Agilent XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 um)色譜柱，于20、30、40 ℃條件下進行測試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀、色譜柱、柱溫等因素的小范圍變化，測得山苓健胃顆粒中甘草酸的含量無明顯差異，耐用性良好，結(jié)果見表3。

表3 耐用性試驗Tab 3 serviceability test

2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品(批號為20140609)的樣品，按2.2項下方法制成供試品溶液，立即測定，再在2、4、6、8、10 h進行測定，結(jié)果RSD為0.45%，表明測定值在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗Tab 4 Stability test

2.9 樣品含量測定 取3批山苓健胃顆粒(批號分別為20140609、20140610、20140611)分別按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，上機測定峰面積，通過外標(biāo)法計算甘草酸的含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測定結(jié)果(mg/g)Tab 5 Content determination results (unit：mg/g)

3 討論與結(jié)論

3.1 含量測定成分的選擇 山苓健胃顆粒處方源于民間驗方，由山楂、茯苓、甘草等藥材組成，采用提取精制的方法制成中藥顆粒劑，具有開胃消滯，健脾除濕之效，用于防治仔豬積滯，脾運失常的脾胃病。因其處方中的山藥、茯苓等未能建立高效準(zhǔn)確的液相檢驗方法，因此，選擇甘草作為山苓健胃顆粒的含量測定指標(biāo)。甘草中含有多種黃酮類化合物、三萜類化合物及香豆素、生物堿、氯基酸、雌性激素、有機酸等多種成分[2-3]。其中三萜類化合物甘草酸是主要活性成分，其含量為5%～11%左右[4]。多項研究表明甘草的主要活性成分三萜類(甘草酸類)能促進胃腸運動并保護肝臟，甘草酸可明顯阻止四氯化碳、術(shù)后內(nèi)毒素、脂多糖等物質(zhì)誘導(dǎo)的肝細胞損傷，并能抑制實驗性肝纖維和早期肝硬化的發(fā)生。脾虛狀態(tài)下，甘草酸能作用腸上皮細胞增值凋亡、促進黏膜起保護修復(fù)作用[1]。因此，山苓健胃顆粒中含量測定的成分選擇甘草酸。采用HPLC 測定山苓健胃顆粒中甘草酸的含量，操作簡便，甘草酸在3.274～49.11 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測方法的準(zhǔn)確度、精密度、日內(nèi)穩(wěn)定性和耐用性均能達到要求。

3.2 樣品前處理方法的選擇 甘草酸一般以鉀鹽或鈣鹽的形式存在于甘草中，具有顯著的生物活性。其提取分離方法主要有稀氨水提取法，氨性醇提取法，酸水提取法，微波提取法等方法[5-6]。參考2015年版《中華人民共和國獸藥典》[7]二部甘草顆粒含量測定項下前處理方法，本試驗采用酸性甲醇作為溶劑，超聲處理30 min，結(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出山苓健胃顆粒中的甘草酸，并且陰性對照無干擾。

3.3 色譜方法的選擇 色譜方法中流動相各組分經(jīng)反復(fù)試驗篩選，最后采用了甲醇-0.2 mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸(65∶35∶1)的比例，處方中各有效成分峰的分離度最好，理論板數(shù)符合液相色譜分析要求，流速為1.0 mL/min條件下，方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

高效液相法測定山苓健胃顆粒中甘草酸的含量，方法簡便，準(zhǔn)確，靈敏度高，回收率好，可有效控制該制劑中甘草的含量。