纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同降解葡萄皮渣條件優(yōu)化

索江華， 唐桂芬， 連艷鮮

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450046）

葡萄皮渣是釀造葡萄酒的副產(chǎn)品， 其除了含有常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有豐富的功能成分，對(duì)動(dòng)物具有特殊作用， 如對(duì)腸道菌群具有很好的調(diào)節(jié)作用（Feng，2019）；抗氧化作用；降低甘油三酯和極低密度脂蛋白含量（Yu，2019）；改善魚(yú)、肉的品質(zhì)（Aditya，2018）等。 但因?yàn)槠浯掷w維含量高，大大降低了其利用率和適口性， 為了能有效提高葡萄皮渣的利用率， 本文通過(guò)纖維素酶和木聚糖酶協(xié)同作用， 利用響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計(jì)和篩選最佳降解葡萄皮渣工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 葡萄皮渣：唐僧寺酒堡提供的赤霞珠釀酒副產(chǎn)品，105 ℃烘至恒重，干物質(zhì)過(guò)40 目篩。

1.2 試劑 0.5 mol/L 鹽酸溶液：4.17 mL 的濃鹽酸加100 mL 的蒸餾水；10.0 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取105 ℃烘至恒重的無(wú)水葡萄糖約1 g，精確至0.0001 g，加檸檬酸鹽緩沖溶液溶解，定容至100 mL。 DNS 試劑： 稱取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，加水500 mL 攪拌溶解，水浴至45 ℃，然后逐步加入氫氧化鈉溶液（200 g/L）、四水酒石酸鉀鈉91.00 g、苯酚2.50 g 和無(wú)水亞硫酸鈉2.50 g，攪拌至溶解，冷卻至室溫后，定容至1000 mL。 過(guò)濾，取濾液貯存于棕色瓶中，避光保存。 室溫下存放7 d 后可以使用，有效期為6 個(gè)月。

1.3 儀器 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器有限公司；A2201 纖維分析儀，北京倫華科技有限公司。

1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分別用檸檬酸緩沖溶液定容至50 mL， 配成濃度為0.00 ～2.00 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列。 分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.00 mL 于25 mL 具塞比色管中，分別加入2.00 mL 水和2.00 mL DNS 試劑，沸水浴5 min。 冷卻至室溫， 用水定容至25 mL，在540 nm 波長(zhǎng)下比色，以吸光度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液含糖的毫克數(shù)為縱坐標(biāo)， 列出直線回歸方程。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 酶濃度比例對(duì)降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 稱取0.32 g/L 的葡萄皮渣樣品， 依次加入pH 4.8 的緩沖溶液1.00 mL， 并分別加入纖維素酶和木聚糖酶配比（g/L）為3：6、4：5、5：4、6：3、7：2的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴鍋中保溫1 h，并設(shè)平行對(duì)照三組， 采用DNS 法得出還原糖含量，確定最適的纖維素酶和木聚糖酶的配比。

1.5.2 反應(yīng)溫度對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 稱取0.32 g/L 的葡萄皮渣樣品， 依次加入pH 為4.0 的緩沖溶液1.0 mL、纖維素酶和木聚糖酶配比為5：4 的酶液0.50 mL 分別于50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中保溫1 h， 并設(shè)平行對(duì)照三組，采用DNS 法得出還原糖含量，確定最適反應(yīng)溫度。

1.5.3 pH 對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響稱取0.32 g/L 的葡萄皮渣樣品， 依次加入pH 為2.4、3.2、4.0、4.8、5.6 的緩沖溶液1.0 mL、 纖維素酶和木聚糖酶配比為5：4 的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴鍋中保溫1 h，設(shè)平行對(duì)照三組，采用DNS法得出還原糖含量，確定最適pH。

1.5.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 稱取0.32 g/L 的葡萄皮渣樣品， 依次加入pH 為4.0 的緩沖溶液1.0 mL、纖維素酶和木聚糖酶配比為5：4 的酶液0.50 mL 于50 ℃的水浴鍋中分別保溫1、6、12、18、24 h，并設(shè)空白對(duì)照和平行對(duì)照，采用DNS 法得出還原糖含量，確定最適反應(yīng)時(shí)間。

1.6 響應(yīng)面法對(duì)酶降解葡萄皮渣影響因素的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)， 進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最優(yōu)方案（趙薇等，2019）。 如表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平

1.7 粗纖維的測(cè)定 根據(jù)GB/T 6434－2006 采用過(guò)濾法測(cè)定粗纖維含量（余水賓，2004）。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法， 得出吸光度值與葡萄糖含量線性關(guān)系如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酶濃度比例對(duì)降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 如圖2 可知，不加酶時(shí)的還原糖量較低，在纖維素酶加入量小于木聚糖酶時(shí)， 葡萄皮渣的還原糖量隨纖維素酶的增加而增加， 當(dāng)增加到一定程度時(shí)又緩慢下降。 當(dāng)纖維素酶的添加量大于木聚糖酶，且纖維素酶和木聚糖酶的比例為5：4 時(shí)，葡萄皮渣的還原糖含量達(dá)到最高。

圖2 酶濃度比例對(duì)還原糖含量的影響

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 如圖3 可知，隨著溫度的不斷增加，葡萄皮渣的還原糖含量也隨之增加， 當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃后， 皮渣的還原糖量開(kāi)始下降。 因此， 當(dāng)溫度為60 ℃處理葡萄皮渣時(shí)得到的還原糖含量最高。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)還原糖含量的影響

2.4 pH 對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響由圖4 可知，還原糖含量隨著pH 的增大而增高，當(dāng)pH 到4.0 時(shí)，還原糖開(kāi)始下降，說(shuō)明pH 過(guò)高會(huì)抑制復(fù)合酶的酶活， 從而影響葡萄皮渣還原糖的含量。 因此，在pH 為4.0 時(shí)，還原糖有一個(gè)波峰，含量達(dá)到最高。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶降解葡萄皮渣生成還原糖的影響 由圖5 可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增大時(shí)，葡萄皮渣的還原糖也隨之緩慢的增加。 但增加到一定程度之后，還原糖的含量開(kāi)始下降。在反應(yīng)時(shí)間為12 h，還原糖的含量達(dá)到一個(gè)峰值。相對(duì)來(lái)說(shuō)，反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖的影響不太大，數(shù)據(jù)波動(dòng)不明顯。還原糖含量下降可能是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)， 還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng)而使其總含量降低。

圖4 pH 對(duì)還原糖含量的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

2.6 纖維素酶和木聚糖酶降解葡萄皮渣的試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.6.1 模型的建立和方差分析 根據(jù)影響酶降解葡萄皮渣單因素分析的結(jié)果， 選擇纖維素酶和木聚糖酶濃度比例（A）、反應(yīng)溫度（B）、pH（C）、反應(yīng)時(shí)間（D）為交互因素，根據(jù)表1 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2。

利用design expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合處理， 獲得葡萄皮渣中以還原糖含量（Y）為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程如下：Y =-1391.49394 +68.53724A +29.65128B +240.86850C+7.36340D-0.17243AB-4.31021AC-0.052222AD -1.17552BC +0.059563BD +0.10777CD-14.48531A2-0.20295B2-20.85869C2-0.42437D2，回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可知，上述二次回歸模型極顯著（P ＜0.01）；模型的調(diào)整系數(shù)R2=0.9106，該模型能解釋91.06%響應(yīng)值的變化。 Radj2=0.8213，因該模型擬合程度比較好，試驗(yàn)誤差小，可以用該模型對(duì)葡萄皮渣還原糖含量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。 由方差分析可知，兩因素B、D 以及二次項(xiàng)C2、D2對(duì)響應(yīng)值影響極為顯著；交互項(xiàng)BC 對(duì)響應(yīng)值影響微顯著；因素A、C 與交互項(xiàng)AB、AC、AD、BD、CD 對(duì)響應(yīng)值影響不顯著； 說(shuō)明4 個(gè)因素在取值范圍內(nèi)對(duì)還原糖影響順序?yàn)镃＞D＞B＞A， 即pH＞時(shí)間＞溫度＞酶濃度比例。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6.2 響應(yīng)面3D 曲面分析 由圖6 可見(jiàn)， 曲面的傾斜度高， 即坡度陡， 說(shuō)明復(fù)合酶濃度比例和pH 這兩個(gè)因素的交互作用極顯著。在酶濃度比例越接近1.4，pH 越接近4.0 h， 所得的還原糖含量越高，即接近等高線中最小橢圓圓心。

圖7 曲面的傾斜度較高，坡度較陡，說(shuō)明反應(yīng)溫度和pH 這兩個(gè)因素的交互作用較顯著。 在pH接近4.0， 反應(yīng)溫度接近60 ℃時(shí)得出的還原糖趨于最高值，即接近等高線中最小橢圓的圓心。

表3 回歸模型分析結(jié)果

圖6 復(fù)合酶添加濃度比例和pH對(duì)還原糖含量的影響

圖7 反應(yīng)溫度和pH 對(duì)還原糖含量的影響

圖8 曲面的傾斜度高，坡度陡，說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間和pH 這兩個(gè)因素的交互作用極顯著。在pH 越接近4.0， 反應(yīng)時(shí)間越接近12 h 時(shí)得出的還原糖趨于最高值，即接近等高線中最小橢圓的圓心。

圖8 反應(yīng)時(shí)間和pH 對(duì)還原糖含量的影響

圖9 曲面的傾斜度一方較高，坡度較陡，說(shuō)明反應(yīng)溫度和復(fù)合酶添加比例這兩個(gè)因素的交互作用較顯著。 在復(fù)合酶添加比例接近7：5，反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)得出的還原糖趨于最高值，即接近等高線中最小橢圓的圓心。

圖9 復(fù)合酶添加比例和溫度對(duì)還原糖含量的影響

圖10 曲面的傾斜度較平緩，坡度較緩，說(shuō)明復(fù)合酶添加比例和時(shí)間這兩個(gè)因素的交互作用不太顯著。 在復(fù)合酶添加比例接近7：5，反應(yīng)時(shí)間為12 h 時(shí)得出的還原糖趨于最高值，即接近等高線中最小橢圓的圓心。

圖10 復(fù)合酶添加比例和時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

圖11 曲面的傾斜度平緩，坡度較緩，說(shuō)明反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間這兩個(gè)因素的交互作用較顯著。 在反應(yīng)時(shí)間接近12 h、反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)得出的還原糖趨于最高值， 即接近等高線中最小橢圓的圓心。

圖11 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)還原糖含量的影響

通過(guò)響應(yīng)面的分析， 可以得出降解葡萄皮渣產(chǎn)生還原糖最佳工藝為：纖維素酶：木聚糖酶的添加比例為7：5、反應(yīng)溫度60 ℃、pH 4.0、反應(yīng)時(shí)間12 h。

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證響應(yīng)面設(shè)計(jì)的可靠性，將上述最佳條件組合進(jìn)行試驗(yàn)， 即稱取一定量的葡萄皮渣，在pH 4.0 的緩沖溶液下潤(rùn)濕，加入比例為7：5 的纖維素酶和木聚糖酶混合溶液，在60℃的水浴鍋內(nèi)反應(yīng)12 h，在波長(zhǎng)540 nm 下測(cè)其吸光度，試驗(yàn)平行三次。 結(jié)果表明，提取的葡萄皮渣中還原糖的含量達(dá)到110.66 mg/L，與預(yù)測(cè)值相差1.9%左右。 表明響應(yīng)面所得的最佳組合適用于葡萄皮渣產(chǎn)生還原糖，試驗(yàn)可行。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)先通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)影響纖維素酶和木聚糖酶組成的復(fù)合酶降解葡萄皮渣效果做了探究，初步找到了單因素的最適條件為：pH 4.0，溫度60 ℃，時(shí)間12 h，纖維素酶和木聚糖酶比例5：4。又通過(guò)響應(yīng)面分析試驗(yàn)得出最適條件組合為：pH 4.0，溫度60 ℃，纖維素酶和木聚糖酶比例7：5，在此條件下，對(duì)0.32 g/L 的葡萄皮渣降解12 h，此時(shí)所得的還原糖最高為110.66 mg/L，與不加酶還原糖量76.63 mg/L 提高了44.4%，差異顯著。