張彐寧,靳曉飛,唐敬龍,趙艷萌,周曉紅,高維娟
(河北中醫(yī)學(xué)院,河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050091)
腦卒中(stroke)發(fā)病率逐年攀升,發(fā)病人群已經(jīng)出現(xiàn)年輕化趨勢(shì),嚴(yán)重影響著居民身體健康和生活質(zhì)量,給患者家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中可分缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類,其中缺血性腦卒中更為多見(jiàn)。溶栓治療是缺血性腦卒中的首選治療方法,由于溶栓后缺血血管的再灌注,會(huì)給患者帶來(lái)再次損傷,故療效不佳。因此,尋求特效藥物已成為防治缺血性腦卒中的研究重點(diǎn)。目前,臨床上應(yīng)用中藥黃芪治療缺血性腦卒中已取得良好效果,但其具體藥效成分尚未完全證實(shí),亟待探究。毛蕊異黃酮(calycosin)是黃芪黃酮類的有效單體成分,研究發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮具有抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝、延緩衰老等生物作用[1],但其在缺血性腦卒中方面尚缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)采用缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞模型,模擬神經(jīng)元體外缺血再灌注的環(huán)境,在細(xì)胞水平,探討毛蕊異黃酮對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞損傷的影響,為篩選黃芪治療缺血性腦卒中的藥效成分提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
PC12細(xì)胞(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系,經(jīng)過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF處理后具有神經(jīng)元的相關(guān)特性)購(gòu)自Boster公司。
毛蕊異黃酮購(gòu)自上海士峰生物制品有限公司,20 mg/瓶,純度≥ 98%;CCK-8試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;Bcl-2抗體、Bax抗體、DAPI染色劑、Cy3和Alexa Fluor488熒光二抗均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;PI染色劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;caspase-3抗體購(gòu)自Gene Tex公司;LDH試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;青鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶購(gòu)自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;Earle’s平衡鹽溶液購(gòu)自安徽雷根生物技術(shù)有限公司;胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司。
SW-CJ-ID型超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化公司;Axio Observer 7型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss公司;DPX-9052B-1型電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;3111型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、Multiskan FC型酶標(biāo)儀、3131型三氣培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。
1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及PC12細(xì)胞模型的建立
將PC12細(xì)胞隨機(jī)分為5 組:正常對(duì)照組(control組)、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)組(model組)、毛蕊異黃酮高劑量(0.140 μmol/L)組、毛蕊異黃酮中劑量(0.070 μmol/L)組、毛蕊異黃酮低劑量(0.035 μmol/L)組。正常對(duì)照組采用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清)于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng),其余各組細(xì)胞均建立缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖細(xì)胞模型:用無(wú)糖Earle’s平衡鹽溶液替代DMEM培養(yǎng)液,置于三氣培養(yǎng)箱(94% N2、5% CO2、1% O2)內(nèi)培養(yǎng)2 h,即氧、糖剝奪2 h,之后模型組更換為DMEM培養(yǎng)液,給藥組則更換為含有不同濃度毛蕊異黃酮(0.140 μmol/L、0.070 μmol/L、0.035 μmol/L)的培養(yǎng)液,放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,即復(fù)氧復(fù)糖24 h。
1.3.2 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性
各組細(xì)胞以1×106/L的密度接種于96孔板,OGD/R造模和給藥處理后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,于CO2培養(yǎng)箱中孵育50 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光(OD)值。OD值越大,細(xì)胞活性越強(qiáng)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。
1.3.3 LDH法檢測(cè)各組細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率
造模和給藥處理后,取出各組細(xì)胞,按照LDH試劑盒操作步驟,在96孔板中分別加入各組細(xì)胞上清液和LDH試劑,充分混勻,室溫靜置5 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光(OD)值,此為細(xì)胞上清液中的LDH含量。之后向原含有細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)加入1% Tritonx-100,室溫破膜20 min后,取細(xì)胞培養(yǎng)液和LDH試劑混勻,室溫靜置5 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光(OD)值,此為細(xì)胞破膜液 LDH釋放量。LDH漏出率(%)=上清LDH/(上清LDH+細(xì)胞破膜液LDH)×100%。
1.3.4 PI熒光染色觀察各組細(xì)胞膜完整性
配制PI工作液20 μg/mL于PBS中,避光配置,現(xiàn)配現(xiàn)用,取出各組細(xì)胞爬片,PBS清洗1 min×3次,加入PI工作液,37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,PBS清洗5 min×3次,待細(xì)胞爬片稍干后,封片,紅染的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞,熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野,觀察各組細(xì)胞的熒光表達(dá)。PI陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。
1.3.5 免疫組化法檢測(cè)各組細(xì)胞caspase-3表達(dá)
細(xì)胞傳代時(shí),進(jìn)行細(xì)胞爬片預(yù)培養(yǎng),之后給予造模給藥處理,取出各組細(xì)胞爬片,用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液固定25 min,室溫干燥5 min,PBS清洗2 min×3次,待爬片甩干后,每個(gè)爬片滴加50~100 μL 0.2% Triton X-100細(xì)胞破膜液,室溫破膜20 min,5%山羊血清封閉20 min,甩掉封閉液后,滴加caspase-3單克隆抗體(1∶600),4℃過(guò)夜,洗去一抗,滴加山羊抗兔IgG(1∶200)二抗,37℃孵育60 min,洗去二抗,DAB顯色15 min,蘇木素復(fù)染10 min,脫水,透明,封片。顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野,采用Image J軟件分析caspase-3平均光密度值,用積分光密度IOD/Area表示。
低噪聲放大器選用飛利浦的BGA2001,它是一款可應(yīng)用于低電壓情況的單片微波集成放大器,最大電源電壓為4.5 V;在1~1.6 GHz頻段內(nèi),即包含衛(wèi)星導(dǎo)航信號(hào)的工作頻段內(nèi),增益高達(dá)20 dB,噪聲系數(shù)低至1.3 dB。圖2是設(shè)計(jì)的低噪放電路。
1.3.6 免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)
各組細(xì)胞爬片、固定、破膜同上述免疫組化步驟,各組細(xì)胞破膜后,加4% BSA室溫封閉30 min,甩掉封閉液后,滴加Bax抗體(1∶100)和Bcl-2抗體(1∶100)50~100 μL于爬片上,4℃過(guò)夜,洗去一抗,滴加山羊抗小鼠IgG(1∶300)和驢抗兔IgG(1∶200)二抗,室溫避光孵育60 min,洗去二抗,滴加DAPI染液室溫避光10 min,封片,熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野,觀察各組細(xì)胞的熒光表達(dá)。Bax為紅色熒光,Bcl-2為綠色熒光,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Bax與Bcl-2的熒光強(qiáng)度值,并計(jì)算Bax/Bcl-2比值。
Control組細(xì)胞形態(tài)飽滿,折光性較好;與control組相比,OGD/R處理后,PC12細(xì)胞的折光性降低,突觸減少,細(xì)胞干癟,細(xì)胞數(shù)量減少;與model組相比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組顯著改善OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,PC12細(xì)胞突觸增多,胞體變圓,且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組細(xì)胞恢復(fù)較好;calycosin高劑量組與model組相比無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。
注:A:正常對(duì)照組;B:模型組;C:毛蕊異黃酮高劑量組;D:毛蕊異黃酮中劑量組;E:毛蕊異黃酮低劑量組。
與control組相比,OGD/R處理后PC12細(xì)胞的活性明顯降低(P<0.05);與model組對(duì)比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可顯著提高OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活性(P<0.05),且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組細(xì)胞活性較高(P<0.05);calycosin高劑量組與model組對(duì)比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與毛蕊異黃酮低劑量組相比,ΔP<0.05。
與control組相比,OGD/R處理后PC12細(xì)胞的乳酸脫氫酶漏出率明顯提高(P<0.05);與model組對(duì)比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可顯著降低OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞乳酸脫氫酶漏出率(P<0.05),且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組乳酸脫氫酶漏出率較低(P<0.05);calycosin高劑量組與model組對(duì)比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。
注:與對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與毛蕊異黃酮低劑量組相比,ΔP<0.05。
PI是一種不透膜的紅色熒光染料,不能通過(guò)活細(xì)胞膜,但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。與control組相比,OGD/R處理后,PC12細(xì)胞紅染數(shù)明顯增多(P<0.05);與model組相比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組紅染細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組細(xì)胞紅染數(shù)較少(P<0.05);calycosin高劑量組與model組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖4。
注:A、a:正常對(duì)照組;B、b:模型組;C、c:毛蕊異黃酮高劑量組;D、d:毛蕊異黃酮中劑量組;E、e:毛蕊異黃酮低劑量組。A~E:倒置熒光顯微鏡相差下拍攝圖片(× 400);a~e:倒置熒光顯微鏡下拍攝的熒光圖片(× 400)。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與毛蕊異黃酮低劑量組相比,ΔP<0.05。
與control組相比,OGD/R處理后PC12細(xì)胞caspase-3表達(dá)顯著升高(P<0.05);與model組相比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組可明顯減少caspase-3表達(dá)(P<0.05),且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組caspase-3表達(dá)較低(P<0.05);calycosin高劑量組與model組對(duì)比差異不明顯(P>0.05)。見(jiàn)圖5。
注:A:正常對(duì)照組;B:模型組;C:毛蕊異黃酮高劑量組;D:毛蕊異黃酮中劑量組;E:毛蕊異黃酮低劑量組。與對(duì)照組相比,*P<0.05;與模型組相比,#P<0.05;與毛蕊異黃酮低劑量組相比,ΔP<0.05。
與control組相比,OGD/R處理后,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05);與model組相比,calycosin中劑量組和calycosin低劑量組Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡程度減輕,且與calycosin低劑量組相比,calycosin中劑量組降低更明顯(P<0.05);calycosin高劑量組與model組對(duì)比無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖6。
目前,早期恢復(fù)血流是治療缺血性腦卒中的最好方法,但恢復(fù)血液供應(yīng)也可能加劇缺血組織損傷,產(chǎn)生較為嚴(yán)重的病理反應(yīng)——腦缺血再灌注損傷,其發(fā)生機(jī)制主要涉及細(xì)胞凋亡、鈣超載、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等因素[2],各因素之間相互作用,致使腦組織產(chǎn)生不可逆性損傷。腦缺血后再灌注引起的遲發(fā)型神經(jīng)細(xì)胞死亡多以細(xì)胞凋亡為主,在線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡途徑中,Bcl-2蛋白家族發(fā)揮著關(guān)鍵作用,caspase-3在啟動(dòng)線粒體途徑細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要角色。Bcl-2家族蛋白可以與孔蛋白相互作用,使位于線粒體內(nèi)、外膜的通透轉(zhuǎn)換孔PTP開(kāi)放,大量的有機(jī)溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜膨脹破裂,CytC、AIF等釋放入胞質(zhì),激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。Bax、Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的重要成員,當(dāng)細(xì)胞受到缺血等刺激時(shí),位于胞質(zhì)中的Bax向線粒體膜聚集,促使線粒體膜通透性改變,進(jìn)而釋放CytC,誘導(dǎo)caspase-3活化,引起細(xì)胞凋亡;而B(niǎo)cl-2作為一種與線粒體相關(guān)的膜穩(wěn)定蛋白,能夠維持和保護(hù)膜的穩(wěn)定性,與Bax形成異源二聚體,抑制caspase-3活化,阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4,5]。
中藥黃芪是臨床常用補(bǔ)氣要藥,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有保元補(bǔ)虛、益衛(wèi)固表、利尿消腫的功效。大量醫(yī)籍記載和實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),黃芪不僅具有補(bǔ)氣保元的作用,還具有良好的活血化瘀之功。古代醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)“氣為血之帥”、“血為氣之母”、“氣能生血”、“氣行則血行”等理論,常以黃芪配伍成方,治療中風(fēng)之半身不遂后遺癥。補(bǔ)陽(yáng)還五湯即為治療中風(fēng)的代表方劑,重用君藥黃芪,意在氣旺則血行,瘀去則絡(luò)脈通暢,在臨床上應(yīng)用至今,尤其在治療缺血性中風(fēng)方面療效顯著[6-10]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃芪的主要活性成分包括黃酮、皂苷、多糖三大類成分[11]。研究者通過(guò)大量離體或在體實(shí)驗(yàn),對(duì)黃芪主要活性成分進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)黃芪三大主要成分在抗炎、抗氧化、調(diào)控自噬、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)干細(xì)胞增值、改善認(rèn)知功能障礙等方面均發(fā)揮著重要作用,其中黃芪黃酮類成分更是受到越來(lái)越多的關(guān)注[12-15]。
黃芪黃酮類化合物主要包括異黃酮、黃酮、異黃烷和紫檀烷四大類,毛蕊異黃酮(calycosin)是異黃酮類代表性有效單體成分,是檢測(cè)黃芪質(zhì)量的重要參考指標(biāo),具有抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老、抗炎、抗心肌肥厚等生物作用。LIU等[16]采用B3LYP方法對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷4種成分進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮的抗氧化活性最為顯著,其抗氧化性明顯高于其它3種成分。朱嘉歡等[17,18]研究表明毛蕊異黃酮與阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可以明顯降低衰老造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)衰老時(shí)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和CDK4 蛋白表達(dá)水平,能夠抑制HSCs衰老和促進(jìn)其增殖。趙海鵬等[19]研究發(fā)現(xiàn),毛蕊異黃酮可通過(guò)激活A(yù)MPK通路,抑制炎癥因子IL-6和IL-8活性和NF-κB的過(guò)度激活,從而減輕PM2.5誘導(dǎo)的小鼠肺泡上皮細(xì)胞系 MLE12細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。
毛蕊異黃酮作為黃芪黃酮類的重要有效單體成分,在抗氧化、抗炎、促進(jìn)細(xì)胞增殖、延緩衰老等方面均有應(yīng)用,但是目前尚缺乏毛蕊異黃酮防治缺血性腦卒中方面的研究,亟需探索。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),建立PC12細(xì)胞的缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)模型模擬神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注環(huán)境,在細(xì)胞水平,探討了不同劑量(高劑量0.140 μmol/L、中劑量0.070 μmol/L、低劑量0.035 μmol/L)毛蕊異黃酮對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,毛蕊異黃酮中、低劑量組可明顯提高OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力,降低乳酸脫氫酶漏出率,有效改善OGD/R引起的PC12細(xì)胞皺縮、膜破壞等現(xiàn)象,降低促凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax表達(dá),提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),從而顯著減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷,其中毛蕊異黃酮中劑量組效果更為顯著,而高劑量組與模型組比較無(wú)明顯差異。表明毛蕊異黃酮可優(yōu)化缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖PC12細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),提高細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護(hù)作用,且其藥物作用無(wú)劑量依賴性。目前,毛蕊異黃酮減輕OGD/R誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷是本課題組針對(duì)毛蕊異黃酮在防治缺血性腦卒中方面的一個(gè)初步探討,其具體作用機(jī)制尚不明朗,本課題組將繼續(xù)深入探討毛蕊異黃酮拮抗腦缺血再灌注損傷、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制,為黃芪治療缺血性腦卒中藥效成分的篩選提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。