7種藥劑對番茄灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定及盆栽防效比較

張慶萍，畢采利，龔 靜，趙存虎，王 輝

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019；3.豐鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)局 推廣站，內(nèi)蒙古 豐鎮(zhèn) 012100）

隨著保護地番茄栽培面積的不斷擴大，番茄的各種病害也在逐年增加，已成為番茄生產(chǎn)中的一大障礙。其中由灰葡萄孢菌引起的番茄灰霉病為當前番茄生產(chǎn)上的重要病害，已在全國各地普遍發(fā)生，并造成嚴重減產(chǎn)減收。一般發(fā)病田塊番茄灰霉病造成的產(chǎn)量損失為20%～40%，重田塊達到60%以上[1]。番茄灰霉病是由半知菌亞門絲孢目灰葡萄孢菌侵染引起的一種發(fā)生較為普遍的世界性病害，番茄灰霉病病菌主要以菌絲體及分生孢子在病殘體內(nèi)或以菌核在土壤中越冬或越夏。在適合的條件下，由菌核萌發(fā)產(chǎn)生的分生孢子，通過雨水、氣流、露水及農(nóng)事操作等進行散播，從花器或傷口侵入，之后進行再侵染。發(fā)病的主要因素為低溫高濕，病菌最適溫度為18～23 ℃。當溫度約20 ℃，相對濕度持續(xù)90% 以上時，病害嚴重，發(fā)病后傳播速度快，嚴重影響綠色食品設施番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)，給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失[2-3]。

目前，在生產(chǎn)上防治灰霉病主要依靠化學殺菌劑，而化學殺菌劑特別是內(nèi)吸性殺菌劑的長期使用，極易使灰葡萄孢菌產(chǎn)生抗藥性，失去防治效果。因此，需要對常用化學殺菌劑進行室內(nèi)毒力測定，不斷篩選出新的替代殺菌劑，以滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。生物殺菌劑的廣泛應用，已成為病蟲害防治的重要組成部分之一，越來越引人注目。因此，本研究通過室內(nèi)毒力測定，篩選出新的可替代的化學和生物殺菌劑，為番茄灰霉病提供更多有效安全的藥劑防治依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

菌株由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學提供，番茄品種CM966。

1.2 供試藥劑

5 種化學殺菌劑：50%啶酰菌胺水分散粒劑（巴斯夫歐洲公司）、500 g/L 異菌脲懸浮劑（江蘇省蘇州富美實植物保護有限公司）、50%乙霉多菌靈可濕性粉劑（江蘇藍豐生物化工股份有限公司）、50%腐霉利可濕性粉劑（日本住友化學株式會社）、40%嘧霉胺懸浮劑（陜西恒田化工有限公司）；2 種生物殺菌劑：3×108CFU/g 哈茨木霉菌可濕性粉劑（美國拜沃股份有限公司）、3×109CFU/g 甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌可濕性粉劑（華北制藥集團愛諾有限公司）。

1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 菌落直徑法測定藥劑對番茄灰霉病菌的抑菌效果

為了準確測定供試7 種藥劑對灰霉病菌的室內(nèi)毒力測定，保證藥劑在稀釋過程中分布均勻，以達到更好的懸浮效果，減少試驗誤差，將5 種供試化學殺菌劑先配成母液，之后稀釋成5 個系列有效成分含量。將PDA 培養(yǎng)基滅菌并冷卻至50 ℃左右，與配好的5 個系列有效濃度藥劑按體積比9∶1 混合，制成5 個系列濃度、直徑9 cm 的含藥平板，以不加藥劑的處理為對照，在每個培養(yǎng)基表面放入1 個直徑5 mm 的供試病原真菌菌餅，置于20 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復3 次[4]。

將2 種生物殺菌劑分別做如下處理：（1）哈茨木霉菌生物殺菌劑制成懸浮液涂布于PDA 平板上進行培養(yǎng)，取恒溫（25 ℃）培養(yǎng)7 d 的產(chǎn)孢哈茨木霉菌，用10 mL 無菌水將哈茨木霉菌孢子沖下后依次制成999，855，750，666，600 μg/mL 的孢子懸浮液。用移液槍吸取孢懸液加入已滅菌的培養(yǎng)基中（孢子液∶培養(yǎng)基=1∶9 體積比）制成含哈茨木霉菌PDA 平板，然后用打孔器打取灰霉病菌菌餅（直徑5 mm）接入含哈茨木霉菌孢子的PDA 平板上，試驗重復3 次。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，采用十字交叉法測量番茄灰霉病菌的菌落生長直徑，取其平均值，計算菌絲生長相對抑制率；（2）甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生物殺菌劑制成懸浮液后涂布于LB 培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d 后將其接種于裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h。 收集發(fā)酵液，離心（10 000 r/min，4 ℃），將上清液用0.22 μm 濾膜過濾除菌即可得到無菌發(fā)酵液，在無菌條件下，用融化的PDA 培養(yǎng)基依次配制成含666，300，186，50，18 μg/mL 發(fā)酵液的平板培養(yǎng)基，以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照，在每個培養(yǎng)基表面放入1 個直徑5 mm 的供試病原真菌菌餅，每個處理3 次重復，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d 后，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長相對抑制率。

將7 種供試藥劑按如下有效成分含量進行室內(nèi)毒力測定：（1）哈茨木霉菌：999，855，750，666，600 μg/mL；（2）甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌：666，300，186，50，18 μg/mL；（3）啶酰菌胺：555，500，415，385，335 μg/mL；（4）異菌脲：1 110，1 000，905，835，770 μg/mL；（5）乙霉多菌靈：1 665，1 430，1 250，1 110，1 000 μg/mL；（6）腐霉利：715，665，625，590，555 μg/mL；（7） 嘧霉胺：832，768，716，668，624 μg/mL。培養(yǎng)3～5 d 后采用十字交叉法測定菌落直徑并記錄。根據(jù)以下公式計算7 種藥劑對菌絲生長的相對抑菌率、抑菌率幾率值、毒力回歸方程以及EC50值。

1.5 盆栽試驗

通過室內(nèi)毒力測定，篩選出5 種化學殺菌劑及2 種生物菌劑最佳用藥濃度，即啶酰菌胺、異菌脲、乙霉多菌靈、腐霉利、嘧霉胺的有效成分含量分別為555，1 110，1 665，715，832 μg/mL；2 種生物殺菌劑哈茨木霉菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的有效濃度分別為999，666 μg/mL。7 種藥劑分別以此有效成分含量進行盆栽試驗，每盆種植2 株幼苗，重復3 盆。將培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿中的灰霉病菌用打孔器打出相同面積的菌片，將菌片接種到番茄葉片上，前12 h 暗培養(yǎng)，濕度保持在95%以上，然后置于光照和黑暗各12 h的20 ℃，濕度在90%以上的條件下進行培養(yǎng)[5]，生物殺菌劑在接菌之前進行噴施，其余藥劑在番茄葉片發(fā)病初期進行噴施，每隔5 d 調(diào)查病葉數(shù)。

2 結果與分析

2.1 7 種藥劑對番茄灰霉病的抑菌率及抑菌率幾率值

由表1可知，哈茨木霉菌、啶酰菌胺、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、異菌脲、乙霉多菌靈、腐霉利、嘧霉胺在處理有效濃度為18～1 665 μg/mL 時，5 種化學殺菌劑啶酰菌胺、異菌脲、乙霉多菌靈、腐霉利、嘧霉胺對灰霉病菌的相對抑菌率分別為73.03%～84.21%，67.76%～73.68%，82.24%～88.16%，20.39%～25.66%，70.39%～83.55%；其抑菌率幾率值分別為：5.61～6.00，5.46～5.63，5.92～6.18，4.17～4.35，5.54～5.98。2 種生物殺菌劑對灰霉病菌的相對抑菌率分別為：76.84%～83.55%，30.26%～71.05%；其抑菌率幾率值分別為：5.73～5.98，4.48～5.55（表1）。

2.2 7 種藥劑對番茄灰霉病的EC50 值比較

藥劑EC50值大小是衡量藥劑毒力大小的重要指標，EC50值越小表明該藥劑的毒力越強[6-8]。由表2可知，7 種藥劑哈茨木霉菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、啶酰菌胺、異菌脲、乙霉多菌靈、腐霉利、嘧霉胺的EC50值大小分別為139.77，140.02，155.96，280.54，139.64，1 815.92，452.90 μg/mL。因此，從EC50值的角度進行比較，在5 種化學殺菌劑中，殺菌毒力強弱依次為乙霉多菌靈＞啶酰菌胺＞異菌脲＞嘧霉胺＞腐霉利；2 種生物殺菌劑中，殺菌毒力強弱為哈茨木霉菌＞甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

2.3 調(diào)查盆栽葉片發(fā)病率

待番茄植株生長5 d 后開始調(diào)查并記錄番茄葉片發(fā)病數(shù)，每隔5 d 調(diào)查1 次，共調(diào)查3 次。第1 次調(diào)查2 種生物殺菌劑哈茨木霉菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的葉片發(fā)病率分別為5.37%，5.32%；5 種化學殺菌劑啶酰菌胺、異菌脲、腐霉利、嘧霉胺、乙霉多菌靈的葉片發(fā)病率分別為4.19%，7.47%，10.24%，9.45%，4.21%；第2 次調(diào)查2 種生物殺菌劑哈茨木霉菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的葉片發(fā)病率分別為7.43%，7.98%；5 種化學殺菌劑啶酰菌胺、異菌脲、腐霉利、嘧霉胺、乙霉多菌靈葉片發(fā)病率分別為5.34%，10.37%，20.14%，19.40%，6.13%；第3 次調(diào)查2 種生物殺菌劑哈茨木霉菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的葉片發(fā)病率分別為7.82%，8.33%；5 種化學殺菌劑啶酰菌胺、異菌脲、腐霉利、嘧霉胺、乙霉多菌靈發(fā)病率分別為5.70%，12.40%，25.17%，20.30%，6.87%。由圖1可知，用菌餅方式接菌時，2 種生物殺菌劑對番茄灰霉病的抑制強弱的趨勢為哈茨木霉菌＞甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌；5 種化學殺菌劑對番茄灰霉病的抑制強弱的趨勢為啶酰菌胺＞乙霉多菌靈＞異菌脲＞嘧霉胺＞腐霉利。

3 討論與結論

就化學殺菌劑而言，啶酰菌胺、乙霉多菌靈、異菌脲在試驗中表現(xiàn)出了較穩(wěn)定且較強的毒力，可在生產(chǎn)中推廣使用。尤其是啶酰菌胺與乙霉多菌靈，對灰霉病病菌菌絲生長的抑制作用明顯高于其他藥劑，并且啶酰菌胺兼具保護和治療作用，兩種藥劑均適合在灰霉病發(fā)生前或發(fā)生初期施用，可廣泛地用于生產(chǎn)實際中。鑒于殺菌劑連續(xù)施用容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，如腐霉利、嘧霉胺為近年常用農(nóng)藥，在生產(chǎn)上也發(fā)現(xiàn)已經(jīng)有了一定的抗性，因此，在實際應用中應該盡可能選擇作用機制不同的多種藥劑交替使用，避免連續(xù)施用，同時應開發(fā)新型復配菌劑，來延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生[9-13]，例如供試藥劑乙霉多菌靈，結合有效的生物菌劑的使用，使番茄灰霉病得到有效控制。關于生物制劑和化學殺菌劑聯(lián)用對葡萄灰霉病的防效是否具有協(xié)同效應，以及復配制劑對植物病害是否具有抑制作用等還需進一步試驗驗證。

表1 7 種藥劑對番茄灰霉病的抑菌率及抑菌率幾率值

表2 7 種藥劑對番茄灰霉病菌的毒力回歸方程及EC50 值

圖1 盆栽葉片發(fā)病率3 次調(diào)查結果的比較

就生物殺菌劑而言，通過室內(nèi)毒力測定，哈茨木霉菌對番茄灰霉病菌的抑菌效果好于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，在盆栽防效試驗過程中，2 種生物殺菌劑都表現(xiàn)較好的抑菌效果。哈茨木霉菌對番茄灰霉病菌的抑菌效果優(yōu)于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。但生物殺菌劑一定要在即將發(fā)病前使用，適用于保護地防治番茄灰霉病。生物殺菌劑的開發(fā)利用對于保護地番茄灰霉病的有效健康防治具有重要意義[14-16]。

5 種化學殺菌劑中，乙霉多菌靈與啶酰菌胺對灰霉病菌抑菌效果最好，EC50值分別為139.64，155.96 μg/mL 時番茄灰霉病菌對其表現(xiàn)敏感；2 種生物殺菌劑中，3×108CFU/g 哈茨木霉菌對灰霉病菌抑菌效果較好，EC50值為139.77 μg/mL 時番茄灰霉病菌對其表現(xiàn)敏感。本研究選用室內(nèi)毒力測定法與盆栽防效試驗方法相結合并相互比較的方法同時研究了7 種供試藥劑對番茄灰霉病的抑制作用。盆栽防效試驗比較接近生產(chǎn)實際，其結果對實際應用更有指導意義。