披堿草屬牧草DNA指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析

張 銳，唐艾嘉，解繼紅，石鳳翎，3，4，趙 彥，3，4

（1.內蒙古農業(yè)大學草原與資源環(huán)境學院，內蒙古呼和浩特 010011；2.中國農業(yè)科學院草原研究所，內蒙古呼和浩特 010010；3.農業(yè)農村部飼草栽培加工與高效利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；4.草地資源教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

披堿草屬（Elymus）是禾本科（Gramineae）小麥族（Triticeae）內種類最多、分布最廣的屬，廣義的披堿草屬包括近150 個種。披堿草屬牧草為中生-旱中生多年生優(yōu)良牧草，是草原和草甸的重要組成部分。披堿草具有抗寒、耐旱、耐堿、抗風沙等特性，是重要的固沙草本植物，也是重要的牧草種質資源，亦可為麥類作物遺傳改良提供優(yōu)異基因資源[1]。遺傳多樣性是保護生物學研究的核心之一，了解物種遺傳變異的大小、時空分布及其與環(huán)境條件的關系，有助于采取科學有效的措施來保護人類賴以生存的遺傳資源，可為植物的分類進化研究提供有益的資料，進而為植物育種和遺傳改良奠定基礎[2]。

DNA 指紋圖譜是先進的遺傳標記系統，具有高分辨率、準確穩(wěn)定，能夠可靠地鑒定出生物個體與群體之間的差異及特點。利用分子標記技術建立DNA指紋圖譜對鑒別品種、品系和選擇雜交親本有著重要的意義[3-4]。ISSR（Inter-simple sequence repeat）是一種以PCR 技術為基礎的高效分子標記技術，由ZIETKIEWICZ 等[5]在1994年提出可用其來檢測SSR間DNA 的序列差異。ISSR 通過利用重復序列加選擇性堿基為引物，對基因組DNA 進行擴增，可使其多態(tài)性產物更為豐富，因而能夠提供更多的遺傳信息，此外還具有重復性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點?，F已應用于分子指紋圖譜、居群遺傳分析和系統進化等研究[6-8]。SRAP （Sequence-related amplified polymorphism）是由美國加州大學作物系LI 等[9]研究蕓薹作物時開發(fā)出來的一種新型分子標記系統，它具有簡便、重復性好、易于分離條帶和測序、成本低等優(yōu)點。在SRAP標記中，引物的設計是關鍵，它獨特的引物將其可檢測基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)域設計成一種無須任何序列信息就能直接進行PCR 擴增。目前，在植物遺傳圖譜構建[10]、作物遺傳多樣性分析[11-12]、基因定位[9]及比較基因組學[13]等方面已成功應用。

本研究利用SRAP 和ISSR 分子標記，構建26 份披堿草屬植物材料的DNA 指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析，從而篩選出適用于鑒定披堿草材料的分子標記，同時獲得供試材料的遺傳背景信息及各材料間的親緣關系，以期為披堿草種質資源收集、保護、育種及綜合評價研究工作提供資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究供試材料為26 份披堿草材料，其中包括國家審定登記的披堿草品種、地方品種和代表性的披堿草種質資源（表1）。所有材料均于2017年6月8日采自中國農業(yè)科學院草原研究所沙爾沁基地。各材料隨機取25 個單株，分別提取單株總基因組DNA，等量混合為DNA 池作為模板保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 DNA 提取與檢測

采用天根植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA 的純度及濃度，滿足實驗要求，存放于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 ISSR 的PCR 擴增和檢測

ISSR 擴增反應的總體積為20 μL：2×Taq Master Mix（其組分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反應緩沖液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL（20～30 ng/μL），引物1 μL（10 ng/μL），ddH2O 8 μL。引物由上海生工合成。PCR 擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀上照相。

1.4 SRAP 的PCR 擴增和檢測

SRAP-PCR 反應液體積為20 μL：2×Taq Master Mix （其組分含有0.1 U/μL Taq DNA Polymerase、2×PCR 反應緩沖液、3 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTPs）10 μL，DNA 模板1 μL，上下引物各加0.5 μL，ddH2O 8 μL，在ABIVERITI 梯度PCR 儀中進行，SRAP 隨機引物由上海生工合成。PCR 擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；然后94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共5 個循環(huán)；再94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 擴增產物通過1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在凝膠成像儀上照相。

1.5 數據分析

在ISSR 和SRAP 電泳圖譜分析中，挑選比較清晰、重復性較好的條帶進行分析，同時將試驗中擴增的每一個條帶均視為一個條帶，然后統計和計算擴增的總條帶數及多態(tài)性條帶數。根據條帶的有無分別記為1，0。本試驗涉及的材料間的遺傳相似系數GS 值，依據Nei-Li 的方法進行計算，其相關的計算公式為：

表1 供試材料

其中，Nij表示供試物種材料i 和j 中所共有的擴增條帶的數目，Ni是材料i 中出現的擴增條帶的數目，Nj表示材料j 中出現的擴增條帶的數目[14]。此外，在分析軟件NTSYS 2.1 中，以不同材料間的遺傳相似系數GS 值為基礎，進行聚類分析[15]。

2 結果與分析

2.1 ISSR 分子標記多態(tài)性分析

試驗采用ISSR 的分子標記方法對26 份樣本篩選出了10 個擴增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物，分別 是UBC807、UBC808、UBC811、UBC818、UBC835、UBC840、UBC844、UBC845、UBC848 和UBC873。由表2可知，10 個引物共擴增出95 個條帶，其中，90 個為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率（PPL）為94.74%，平均每個引物擴增出9.5 個條帶，9.0 條多態(tài)性條帶。擴增片段長度集中在250～1 000 bp，擴增的條帶數在4～16 個。ISSR 引物UBC848 對供試材料的擴增圖譜見圖1。該引物共擴增出14 個條帶，且均為多態(tài)性條帶，PPL 值為100%；類似的引物還有UBC807、UBC808、UBC840、UBC844 和UBC873，其擴增的條帶也均為多態(tài)性條帶。

表2 ISSR 引物序列及其擴增結果

圖1 引物UBC848 對供試材料的擴增圖譜

2.2 SRAP 分子標記多態(tài)性分析

利用SRAP 分子標記方法對26 份披堿草材料篩選出了10 對擴增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物，分 別 是 me2 +em13、me3 +em4、me3 +em15、me4 +em13、me4+em14、me4+em16、me9+em12、me9+em14、me9+em15、me10+em1。由表3可知，10 對引物共擴增出110 條清晰條帶，平均每對引物擴增的條帶數為11 條。其中，多態(tài)性條帶100 條，所占比率為90.91%，每對引物的平均多態(tài)性條帶數為10 條擴增出的片段長度在50～400 bp。引物me4+em13 的擴增圖譜見圖2。

2.3 遺傳相似系數與聚類分析

遺傳多樣性的高低可通過遺傳相似系數的大小來表達，種質間遺傳相似系數越小，彼此間親緣關系越遠，說明遺傳多樣性豐富；反之，遺傳相似系數越大，彼此間親緣關系越近，則遺傳多樣性越低。本研究利用NTSYS 軟件，以Dice 遺傳相似系數（GS 值）為基礎，計算出26 份披堿草屬材料間的遺傳相似性系數變幅為0.57～0.89，平均值為0.73，種質間親緣關系遠近程度不一，也說明供試披堿草材料間存在較為豐富的遺傳多樣性。其中，康巴垂穗披堿草和垂穗披堿草（CF025446）間的遺傳相似系數GS 值最高（0.893），親緣關系最近。察北披堿草和垂穗披堿草（CF030026）2 個品種間的遺傳相似系數GS 值最低（0.546），親緣關系最遠。

依據遺傳相似性系數，采用UPGMA 法對ISSR和SRAP 標記的26 份披堿草材料進行聚類分析（圖3）。在GS 為0.67 處將26 份披堿草材料分為4 類。第1 類主要包括10 份披堿草材料：康巴垂穗披堿草、垂穗披堿草（CF025446）、青牧1 號老芒麥、垂穗披堿草（CF030026）、川草2 號老芒麥、青海湟源披堿草、同德老芒麥、⑥DY、農牧老芒麥和垂穗披堿草。其中，3 份來源于青海、2 份來源于四川、2 份來源于吉林、2 份來源于內蒙古、1 份來源于新疆。第2 類包括9 份披堿草材料：紫芒披堿草、圓柱披堿草（DY）、甘南垂穗披堿草、圓柱披堿草（CF016717）、同德短芒披堿草、紫黑披堿草（CF016709）、青海短芒披堿草、紫芒披堿草（CF016976）和四川紅原老芒麥。其中，4 份來源于青海、3 份來源于甘肅、2 份來源于四川。第3 類包括5 份披堿草材料：察北披堿草、DY、天山披堿草、新疆伊犁垂穗披堿草和圓柱披堿草。其中，2 份來源于青海、2 份來源于新疆、1 份來源于河北。第4 類包括2 份披堿草材料：紫黑披堿草（CF16711）和紫芒披堿草（CF016977），分別來源于四川和內蒙古，這2 份材料的遺傳背景與其他材料存在較大的差異，親緣關系較遠，表現出遺傳特異性。

表3 SRAP 引物序列及其擴增結果

圖2 引物me4+em13 對供試材料的擴增圖譜

2.4 指紋圖譜的構建

2.4.1 ISSR 指紋圖譜的構建 ISSR 引物UBC818對26 個披堿草材料的擴增結果見圖4。由圖4可以看出，該引物共擴增出16 個多態(tài)性條帶，PPL 值為100%，所擴增條帶清晰、豐富，且26 份材料分別擴增出的條帶互不相同，能夠彼此區(qū)分，因此將引物UBC818 作為鑒別26 份披堿草材料的分子標記，并建立了披堿草材料ISSR 指紋圖譜，其結果見表4。

2.4.2 SRAP 指紋圖譜的構建 SRAP 引物me4+em16 對26 個披堿草材料的擴增結果如圖5所示，這對引物共擴增出16 個多態(tài)性條帶，PPL 值為100%，擴增條帶清晰、豐富，且26 個樣本分別擴增出的條帶互不相同，能夠彼此區(qū)分，因此引物me4+em16 可以作為鑒別這26 份披堿草材料的分子標記，由此用該標記建立了披堿草材料的SRAP指紋圖譜，其結果見表5。

圖3 26 份披堿草基于遺傳相似系數的UPGMA 聚類結果

圖4 引物UBC818 對供試材料的擴增圖譜

3 討論

遺傳多樣性是物種攜帶遺傳信息的總和，反映該生物在特定生存條件下基因的豐富程度，是育種研究工作中最有價值的物質基礎，而親緣關系分析和指紋圖譜構建對于品種保護和新品種定向選育具有重要意義[16-17]。ISSR 和SRAP 分子標記技術都具有簡便、快速、穩(wěn)定性和重復性較好等特點，在植物遺傳多樣性分析和遺傳作圖中有著廣泛的應用。已有研究結果表明[14，18-19]，這些分子標記對披堿草遺傳多樣性的分析很有成效，本研究結果也證明了這一點。

表4 26 份披堿草材料的ISSR 指紋圖譜

圖5 引物me4+em16 對供試材料的擴增圖譜

多態(tài)性百分率是衡量種群間遺傳變異情況的重要指標。多態(tài)性百分率越高，遺傳背景越豐富，適應能力越強，反之則弱。在本研究中，ISSR 和SRAP 標記分別擴增出較高的多態(tài)性條帶95 條和90 條，多態(tài)性條帶百分率（PPL）分別為94.74%和90.91%，這說明本研究中的26 份披堿草種質資源的遺傳多樣性水平比較豐富。鄭經紅等[14]采用ISSR 技術對25 份西北高原的野生垂穗披堿草種質進行分析，結果顯示多態(tài)性條帶比率為70.8%；陳智華等[20]采用SRAP技術對來自我國四川、西藏、青海、新疆等地的68 份垂穗披堿草種質進行了多態(tài)性分析，結果顯示多態(tài)性條帶比率達85.39%。這些研究結果均說明供試披堿草材料具有豐富的遺傳多樣性。多態(tài)性條帶比率之所以有這樣的差別，原因可能是供試材料種類和來源地有所不同。

表5 26 份披堿草材料的SRAP 指紋圖譜

從供試材料的聚類圖可以看出，本研究中的供試材料的遺傳背景與其地理來源有一定的相關性，但并不是很明顯。比如，第1 類主要包括10 份披堿草材料，其中，3 份來源于青海、2 份來源于四川、2 份來源于吉林、2 份來源于內蒙古、1 份來源于新疆。第2 大類中包括9 份披堿草材料，其中，4 份來源于青海、3 份來源于甘肅、2 份來源于四川。兩大類材料均集中分布在西北地區(qū)。這可能與本研究所用材料大部分來自地域廣闊、生境復雜的地區(qū)，各地理類群海拔、經緯度、溫度、濕度和環(huán)境等都有差別，造成了較大的遺傳變異[20]。此外，還可能與不同種源材料異地引種選育、推廣利用有關，所以從DNA 水平鑒定，兼顧形態(tài)特征評價，才能準確鑒定各品種和代表性種質材料，理清各材料的親緣關系，為種質材料的合理利用提供科學依據。

4 結論

本研究利用ISSR 和SRAP 分子標記對26 份披堿草材料進行了遺傳多樣性分析，將供試材料聚為4 大類；利用篩選出的ISSR 引物UBC818 以及SRAP 引物me4+em16 構建了DNA 指紋圖譜，可用于鑒別26 份供試材料。ISSR 和SRAP 分子標記能夠充分揭示披堿草不同品種（種質）間存在的遺傳差異，均可用于披堿草種質資源的遺傳評價、種質鑒定等研究工作。