超臨界溶液浸漬法制備丁香酚-殼聚糖食品活性包裝膜

唐 川，楊 銘，盧 軒

（大連大學生命科學與技術(shù)學院，遼寧 大連 116622）

食品包裝具有防止食品受到氧化、微生物或其他因素影響的作用，可以保障食品品質(zhì)，延長貨架期[1]。目前市面上的食品包裝大部分采用聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯等高分子材料制成，在自然環(huán)境中難以降解，易造成環(huán)境污染；并且這些材料與食品直接接觸可能會產(chǎn)生有害物質(zhì)，對食品造成污染[2]。隨著人們對食品質(zhì)量及食品安全要求的不斷提高，傳統(tǒng)食品包裝已不能滿足人們的需求。近年來，食品活性包裝作為一種新型包裝引起人們的廣泛關(guān)注[3]。食品活性包裝可通過負載去氧劑、抑菌劑、干燥劑等活性物質(zhì)改變包裝食品的環(huán)境條件、改進食品安全性和感官品質(zhì)，具有良好的應用前景[4]。

殼聚糖是幾丁質(zhì)經(jīng)脫乙酰得到的產(chǎn)物，在自然界中儲量巨大，殼聚糖無毒、可食用、成膜性好，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在生物醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應用廣泛[5-6]，將殼聚糖制備成膜、微粒、復合膜等形式用于食品包裝的研究已有很多報道[7-9]。為了更好地發(fā)揮食品包裝抗氧化、抑菌、干燥等功能，通常采用在食品包裝中加入相應活性物質(zhì)來達到特定的功能[10-11]。丁香酚（eugenol，EG）是丁香揮發(fā)油中的主要成分，具有較強的抑制細菌、真菌作用，是良好的天然抑菌劑[12]。將丁香酚負載于膜材料中是制備抑菌包裝的一種有效策略[13-14]。目前，將活性物質(zhì)負載于包裝材料中的方法主要是在包裝材料加工階段將活性物質(zhì)直接混入或?qū)b材料浸沒于活性物質(zhì)溶液中。這些方法在處理過程中會使用大量有機溶劑或需要在較高溫度下操作，易導致活性物質(zhì)失活、分布不均勻和產(chǎn)品有機溶劑殘留等問題，因此尋找一種安全有效的方法將活性物質(zhì)負載到包裝材料中制備食品活性包裝變得十分迫切。

超臨界溶液浸漬（supercritical solution impregnation，SSI）法是一種將小分子物質(zhì)負載到聚合物中的技術(shù)[15]。SSI過程中，活性物質(zhì)溶解于超臨界二氧化碳（supercritical-CO2，SC-CO2）中，隨SC-CO2擴散進入基質(zhì)材料并與基質(zhì)材料充分接觸，隨后活性物質(zhì)與基質(zhì)材料發(fā)生相互作用吸附于基質(zhì)材料中，泄壓后，活性物質(zhì)均勻負載于基質(zhì)材料中，形成具有相應活性的基質(zhì)材料[16]。SSI不改變基質(zhì)材料結(jié)構(gòu)，活性物質(zhì)在基質(zhì)中分布均勻，負載量可通過改變SSI過程參數(shù)進行調(diào)節(jié)，并且操作條件溫和、不使用有機溶劑、對環(huán)境友好，在食品加工過程中具有極大潛力。但目前SSI的研究主要集中在印染及醫(yī)藥領(lǐng)域[17-18]，在食品工業(yè)中的研究尚處于起步階段[19]。

本實驗擬采用殼聚糖膜（chitosan film，CSF）為基質(zhì)，利用SSI將丁香酚負載于殼聚糖膜中用于食品活性包裝。研究SSI過程參數(shù)對丁香酚負載量的影響，考察負載丁香酚殼聚糖膜（EG-CSF）形貌、水蒸氣透過率、吸水率及抑菌等性質(zhì)，以期為SSI制備食品活性包裝的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度85.0%、黏度154 mPa·s） 濟南海得貝海洋生物工程有限公司；丁香酚（純度＞99.0%）美國Sigma-Aldrich公司；CO2（食品級，純度＞99.9%）大連永豐氣體有限公司；冰醋酸、甘油（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphlycoccus aureus）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 大連大學生命科學與技術(shù)學院。

1.2 儀器與設(shè)備

SFE-500MR-2-FMC10 SSI裝置 美國Waters公司；S-4800掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；Magna-550II紅外光譜儀美國尼高力公司；DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DZF-6021真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖膜的制備

殼聚糖膜采用溶液澆注法制備，將殼聚糖溶解于體積分數(shù)為1%的冰醋酸水溶液中，配制成0.02 g/L的殼聚糖溶液，并向殼聚糖溶液中加入甘油作為塑化劑，加入量為殼聚糖溶液體積的1%，取5 mL殼聚糖溶液倒入截面積為100 mm×100 mm的聚四氟乙烯皿中，40 ℃真空干燥12 h，脫模后得到殼聚糖膜。得到的殼聚糖膜密封保存于25 ℃、（55±3）%相對濕度的干燥皿中備用。

1.3.2 負載丁香酚殼聚糖膜的制備

EG-CSF采用SSI進行制備，SSI設(shè)備如圖1所示。該系統(tǒng)主要由一個帶加熱夾套及攪拌器的100 mL高壓釜、一個高壓泵以及泄壓閥組成，高壓釜的溫度、壓力及泄壓過程由計算機控制，壓力精度±0.1 MPa，溫度精度±1 ℃，泄壓速率精度±0.1 MPa/min。實驗流程參照本課題組之前的研究[20]：將丁香酚置于高壓釜中，丁香酚可使高壓釜內(nèi)SC-CO2達到飽和，殼聚糖膜包裹于濾紙中置于高壓釜攪拌槳上部，不與丁香酚相接觸；CO2經(jīng)冷卻槽冷卻至0 ℃，通過高壓泵送入高壓釜中，待高壓釜中溫度、壓力達到設(shè)定值后，浸漬2 h；達到浸漬時間后，關(guān)閉高壓泵，打開泄壓閥，以一定速率進行泄壓；實驗結(jié)束后取出樣品置于密封袋中，保存于干燥皿中，等待進一步的表征。

圖 1 SSI過程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SSI process

1.3.3 EG-CSF形貌的觀察

EG-CSF的形貌采用SEM進行觀察。將EG-CSF通過碳膠帶固定于樣品臺上，噴金處理60 s后，利用SEM觀察其形貌。

EG-CSF的厚度采用螺旋測微儀進行測定。在EG-CSF樣品上隨機選取5 個點進行厚度測量，計算平均值作為膜厚，用于后續(xù)EG-CSF水蒸氣透過率的計算。

1.3.4 EG-CSF負載量的測定

EG-CSF中丁香酚負載量通過質(zhì)量法進行測定，SSI前采用分析天平對殼聚糖膜質(zhì)量進行測定，記為m0/g；SSI完成后，待EG-CSF質(zhì)量恒定時，對EG-CSF質(zhì)量進行測定，記為m1/g，EG-CSF中丁香酚負載量可通過公式（1）進行計算。

1.3.5 EG-CSF吸水量的測定

EG-CSF樣品測量質(zhì)量，記為m0/g，隨后浸沒于去離子水中，待樣品完全溶脹后取出，使用濾紙拭去樣品表面水滴后稱質(zhì)量，記為m1/g，每個樣品測定3 次，根據(jù)公式（2）計算EG-CSF吸水量。

1.3.6 EG-CSF水蒸氣透過率的測定

EG-CSF水蒸氣透過率按照美國材料與試驗協(xié)會E96-16[21]方法測定。選用直徑40 mm的透濕杯，內(nèi)裝3 g無水氯化鈣，用EG-CSF將透濕杯口覆蓋并密封固定，稱質(zhì)量后置于干燥器中。干燥器中盛有飽和氯化鈉溶液保持相對濕度75%，并置于30 ℃培養(yǎng)箱中。每12 h稱量一次，累積測定1 周，記錄透濕杯質(zhì)量的增加量，每個樣品測定3 次，根據(jù)公式（3）計算水蒸氣透過率。

式中：△m/△t為單位時間內(nèi)增加的水的質(zhì)量/（g/s）；l為EG-CSF厚度/m；A為有效的擴散面積/m2；△P為EG-CSF兩側(cè)的水蒸氣滲透壓差/Pa。

1.3.7 EG-CSF傅里葉變換紅外光譜的表征

采用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法（attenuated total reflection fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR）對殼聚糖膜浸漬前后進行掃描，樣品測試前進行空白校正，扣除背景吸收，掃描波數(shù)400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描32 次。

1.3.8 EG-CSF抑菌性的測定

EG-CSF抑菌性能通過紙片法進行測定，考察EG-CSF對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌生長抑制情況。將3 種細菌分別在LB培養(yǎng)基中37 ℃下培養(yǎng)8 h進行活化，活化后在胰蛋白酶大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）板上培養(yǎng)得到單菌落。挑取單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)8 h。將菌液稀釋10 倍體積，取200 μL涂布于TSA平板，然后將直徑為10 mm的EG-CSF置于平板上，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測量EG-CSF抑菌圈直徑，每個樣品測定3 次。同時取空白CSF作為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 7.5軟件作圖。采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan’s多重比較檢驗法進行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著）。數(shù)據(jù)以平均值±標準差形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 EG-CSF形貌

采用SEM對SSI前后殼聚糖膜形貌進行了表征。圖2a為溶液澆注法制備得到殼聚糖膜，圖2b為殼聚糖膜由SSI在20 MPa、1 MPa/min操作條件下制備得到的EG-CSF樣品。由結(jié)果可見，經(jīng)過SSI負載丁香酚后，殼聚糖膜表面沒有明顯形貌變化，說明SSI對殼聚糖膜的形貌無影響。此外，SSI后，EG-CSF表面無明顯丁香酚顆?；蛞旱胃街Y(jié)合操作過程中殼聚糖膜采用濾紙包裹不與丁香酚直接接觸，與EG-CSF負載量結(jié)果可知，SSI過程中丁香酚的負載并不是簡單地由泄壓時丁香酚在殼聚糖膜表面析出完成，而是由SC-CO2將丁香酚溶解后，以分子狀態(tài)擴散進入殼聚糖膜中，泄壓后以分子狀態(tài)分散于殼聚糖膜中，這一結(jié)果也與之前的研究結(jié)果[22]相符。

圖 2 CSF及EG-CSF掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of CSF and EG-CSF

2.2 EG-CSF負載量

SSI可通過調(diào)節(jié)過程參數(shù)調(diào)控活性物質(zhì)在基質(zhì)中的負載量。根據(jù)之前的研究[16]，SSI達到浸漬平衡后，浸漬時間對過程影響較小，2 h可以保證SSI達到浸漬平衡。因此，本研究考察了浸漬溫度40 ℃、浸漬時間2 h條件下，浸漬壓力（10、15、20 MPa）及泄壓速率（1、5 MPa/min）對丁香酚在殼聚糖膜中負載量的影響。各條件下EG-CSF中丁香酚的負載量結(jié)果如表1所示，EG-CSF中丁香酚在浸漬壓力20 MPa、泄壓速率1 MPa/min時負載量最大，為6.02%；浸漬壓力10 MPa、泄壓速率5 MPa/min時負載量最小，為4.59%。在同一壓力下，泄壓速率為1 MPa/min時，EG-CSF負載量大于泄壓速率為5 MPa/min時的EG-CSF負載量，這是由于在較高的泄壓速率下，溶解有丁香酚的SC-CO2會以更快的速度離開基質(zhì)材料，最終導致負載量降低[23]。這種泄壓速度對EG-CSF負載量的影響在較高壓力時更加明顯，因為在較高壓力時，基質(zhì)材料的溶脹程度更大[24]，更加利于溶有丁香酚的SC-CO2向基質(zhì)外的擴散，并且更高的壓力下，丁香酚在SC-CO2中的溶解度也更大[25]。在這些原因的共同作用下，較高的泄壓速度會導致EG-CSF的負載量降低，并且在較高的壓力下，這種現(xiàn)象更加明顯。從結(jié)果中還可以看出，在泄壓速度較低時，隨著壓力的增加，EG-CSF的負載量有增大趨勢，但在泄壓速度較大時，壓力對EG-CSF負載量的影響并不明顯。

表 1 40 ℃、SSI浸漬2 h后，EG-CSF負載量、厚度、吸水率、水蒸氣透過率Table 1 LC, thickness, WU and WVP of EG-CSF prepared by SSI

2.3 EG-CSF吸水率及水蒸氣透過率

水分在食物的保存過程中起到至關(guān)重要的作用，因此本研究對EG-CSF的吸水率及水蒸氣透過率性能進行了考察，結(jié)果如表1所示。負載丁香酚后的EG-CSF與空白CSF相比，吸水率大幅下降，這是由于SSI后，疏水性物質(zhì)丁香酚嵌入至親水性的CSF中，與殼聚糖中的羥基及氨基產(chǎn)生氫鍵或共價鍵，減弱了殼聚糖與水分子之間的相互作用，使得CSF的親水性下降，最終導致EG-CSF的吸水率降低[26]。

CSF的水蒸氣透過率經(jīng)過SSI負載丁香酚后同樣出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。這可能是由于丁香酚在EG-CSF表面及內(nèi)部均勻的負載，形成了水蒸氣屏障，阻礙了水蒸氣的滲透擴散；另一方面，殼聚糖在SSI過程中可能發(fā)生了殼聚糖分子鏈的重排，改變了其水蒸氣滲透性能[27]。在這兩方面的作用下，使得EG-CSF的水蒸氣透過率下降。這對于EG-CSF在食品包裝中的應用是十分有利的，食品包裝要求膜材料具有較低的水蒸氣透過率，可以減少食物與環(huán)境之間水分轉(zhuǎn)移[28]。

2.4 EG-CSF FTIR分析結(jié)果

丁香酚原料、殼聚糖膜以及SSI后殼聚糖膜和EG-CSF的FTIR分析結(jié)果如圖3所示。由圖3中曲線b和c可知，空白殼聚糖膜經(jīng)SC-CO2過程處理前后的FTIR光譜未見明顯變化，說明SSI對殼聚糖膜的化學結(jié)構(gòu)無影響；由圖3中曲線a可知，丁香酚在1 517.5 cm－1處具有吸收峰，該峰由苯環(huán)的振動引起，結(jié)合圖3中曲線d在1 514 cm－1處出現(xiàn)峰值，說明丁香酚可通過SSI負載至殼聚糖膜中。

圖 3 原料及EG-CSF的 FTIR圖Fig. 3 FTIR spectra of raw materials and EG-CSF

2.5 EG-CSF抑菌性能

EG-CSF作為食品活性包裝，其抑菌性能對其應用具有重要意義。本研究采用抑菌圈法考察了EG-CSF對3 種常見致病菌的生長抑制情況，結(jié)果如表2所示。EG-CSF對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌均有抑制作用，且對金黃色葡萄球菌抑制作用強于大腸桿菌及綠膿假單胞菌。這是由于丁香酚對于革蘭氏陽性菌的抑制作用強于對革蘭氏陰性菌的抑制作用[29]。并且由表2可見，隨著EG-CSF中丁香酚負載量的增加，對細菌生長的抑制作用增強，這是由于丁香酚對細菌的生長抑制作用具有濃度依賴性[12]?？瞻證SF未表現(xiàn)出對供試菌的生長抑制作用，說明EG-CSF對供試菌的生長抑制作用源于其中負載的丁香酚。

表 2 EG-CSF對供試菌的抑菌圈直徑Table 2 Diameters of inhibition zones of three bacteria when exposed to EG-CSF

3 結(jié) 論

采用SSI將丁香酚負載于殼聚糖膜中，通過調(diào)節(jié)SSI過程參數(shù)可調(diào)節(jié)EG-CSF中丁香酚的負載量，負載量最高為6.02%。SSI后EG-CSF的吸水率和水蒸氣透過率較空白CSF均有下降。EG-CSF對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌和綠膿假單胞菌，并且抑制作用與丁香酚負載量相關(guān)。本研究利用SSI將丁香酚負載于殼聚糖膜中，過程條件溫和且避免了有機溶劑的使用，EG-CSF中丁香酚負載量可調(diào)，且具有良好的抑菌效果，可應用于食品活性包裝領(lǐng)域。