葛芪平渴丸的質量標準研究

辛玲歌 趙 銳

陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000

“葛芪平渴丸”是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)以辨證論治為基礎，根據(jù)中醫(yī)藥理論，結合臨床實踐，總結多年的經(jīng)驗組方，由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等14味中藥材組成，具有益氣健脾、清熱生津、活血化瘀的功效，臨床上多用于Ⅱ型糖尿病合并肥胖、血脂異常、胰島素抵抗屬氣陰兩虛，熱毒夾瘀者，可有效控制Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥。通過長期的臨床應用和對患者的隨訪，該方療效顯著，不良反應及毒副作用小，使用安全，且價格低廉，深受廣大患者的好評。方中葛根為君藥，為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根，多于秋、冬二季采挖。味甘、辛，性涼。歸脾胃肺經(jīng)，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉的功效。臨床多用于外感發(fā)熱、口渴、消渴等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，葛根素能夠減少Ⅱ型糖尿病模型小鼠體內蛋白激酶R樣內質網(wǎng)激酶(PERK)、真核起始因子 2a(eIF2a)和葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)含量，降低腎臟內質網(wǎng)應激性，達到降低血糖作用[2]。葛根總黃酮通過降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠體內血清中還原型谷胱甘肽(GSH)、一氧化氮合成酶(NOS)等含量，提升胰腺組織相關蛋白酶表達，達到降低血糖、血脂作用[3]。

中藥方劑大多以傳統(tǒng)的湯劑劑型為主，然而湯劑在煎煮前需浸泡，煎煮過程中需控制煎煮時間及次數(shù)，遇到特殊中藥材需用特殊的方法進行煎煮，并且湯劑在服用時具有口感差、服用量大、易變質、攜帶不便等缺點，給現(xiàn)代生活節(jié)奏越來越快的人們帶來了諸多不便。為了方便患者服用，適應時代的發(fā)展，我院藥劑科制劑室對湯劑劑型進行改良，研制了葛芪平渴丸，方便患者的服用與攜帶，市場前景廣闊，具有開發(fā)意義。為保證葛芪平渴丸的質量，本研究從薄層色譜法、高效液相色譜法兩方面入手，制定該制劑的質量標準，為臨床安全用藥提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、YP5002電子天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)、DYQC型醫(yī)用超聲波提取器(連云港歐倍潔醫(yī)療設備有限公司)、DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)、HH-2電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、ZF-20D型暗箱式紫外分析儀(上海光豪分析儀器有限公司)。

1.2 試藥 葛根素對照品(批號：110752-201514)。葛根對照藥材(批號：121551-201601)、薏苡仁對照藥材(批號：121254-201203)、黃連對照藥材(批號：120913-201109)均由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純(天津歐密科試劑公司)、其他所用化學試劑均為分析純、娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別[4]

2.1.1 葛根[5-7]取適量葛芪平渴丸置于研缽中，研細，稱取粉末10.7 g，置于具塞的錐形瓶中，量取并加入甲醇30 mL，放入超聲儀，20 min后取出，取濾液蒸干，精密量取甲醇0.5 mL使殘渣溶解，即為供試品溶液。稱取葛根對照藥材0.8 g，葛根對照藥材溶液的制備方法同上。再取不含葛根的其他藥材，同樣品制備工藝制備葛根陰性對照樣品，稱取陰性對照品10.5 g，同法制成葛芪平渴丸葛根陰性對照品溶液。參照(《中國藥典》2015年版四部通則0502)，精密吸取供試品溶液、葛根對照品溶液、陰性對照品溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑的比例為：三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結果如圖1所示。

2.1.2 薏苡仁[8]葛芪平渴丸放于研缽中，研細，準確稱取粉末 25.3 g，置于具塞的錐形瓶中，量取并加入石油醚(60～90 ℃)100 mL，超聲儀 30 min后取出，取濾液蒸干，精密加入石油醚(60～90 ℃)1 mL使殘渣溶解，即為供試品溶液。稱取薏苡仁對照藥材1.2 g，薏苡仁對照藥材溶液制備方法同上。再取除薏苡仁藥材外的其他藥材，按處方中藥味比例及葛芪平渴丸的工藝制成陰性對照品，稱取陰性對照品25.6 g，同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，準確吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-醋酸(25∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。如圖2所示。

2.1.3 黃連[9-10]葛芪平渴丸研細，稱取粉末20.3 g，放入具塞的錐形瓶中，量取并加入50 mL甲醇，冷浸1 h后，取濾液低溫蒸干，精密加入甲醇1 mL溶解殘渣，即為供試品溶液。稱取黃連對照藥材2.4 g，黃連對照藥材制備方法同上。再取不含黃連的其余藥材，按處方中藥味比例、工藝制成不含黃連的陰性樣品，稱取陰性對照品20.6 g，同葛芪平渴丸供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，分別吸取供試品溶液、黃連對照藥材溶液、陰性對照品溶液各5 μL，分別點于同一高效硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)為展開劑，在另側槽中加入與展開劑等體積的濃氨試液，預平衡15 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結果如圖3所示。

1～3.供試品 4.薏苡仁對照藥材 5.薏苡仁陰性對照品溶液圖2 薏苡仁TLC色譜

1～3.供試品 4.黃連對照藥材 5.黃連陰性對照品溶液圖3 黃連TLC色譜

2.2 含量測定[11-15]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18(5μm，250 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-水(25∶75)；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；理論板數(shù)按葛根素計算應不低于：3000。

2.2.2 制備葛根素對照品溶液 精密稱取葛根素對照品2.45 mg，置于25 mL容量瓶中，30%乙醇溶解，定容至刻度，制成每50 mL含4.92 mg的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量樣品研成細粉，精密稱取1.0275 g，放于具塞錐形瓶中，精密移取并加入50 mL 30%乙醇溶液，密塞，準確稱量并記錄，放入超聲儀中，30 min后，取出，放至室溫，稱量并記錄，用30%乙醇溶液補足超聲損失的重量，充分搖勻，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

學者們一般看重鉞體現(xiàn)禮制這方面的功能，這誠然不錯，但不能忽視鉞還是重要的舞具，中國古代，歌舞樂三位一體，總稱為樂。禮與樂共同構成中國古代的政治文化。禮別異，強調的是社會上人的等級，以維護統(tǒng)治階級的威權和地位；而樂則重在和樂人們的情感，讓社會各色人等在同樂的情景下實現(xiàn)和諧。

2.2.4 陰性干擾試驗 取不含葛根的其余藥材，按處方中藥味比例、工藝制成不含葛根的陰性樣品。再根據(jù)“2.2.3”項下方法制備陰性對照品溶液。精密量取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，設定方法，測定。根據(jù)液相色譜圖，陰性對照品在葛根素相對保留時間處未見色譜峰，陰性対照液色譜中則無此峰，結果顯示陰性樣品對該方法檢測幾乎無干擾,如圖4所示。

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取葛根素對照品溶液(C=0.098 mg/mL)1、2、3、4、5 mL，置于5 mL容量瓶中，以30%乙醇溶解并定容至刻度。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。以葛根素的進樣量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=4976.5X-40.04，r=0.9998(n=6)，結果表明，葛根素在0.196～0.980 μg范圍內，峰面積線性關系良好，線性回歸曲線如圖5所示。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取批號為150112的葛芪平渴丸，制備供試品溶液，分別于 0 h、4 h及 8 h，精密吸取供試品溶液 10 μL，按擬定色譜條件，測定葛芪平渴丸中葛根素的峰面積，結果葛根素峰面積值的RSD%=1.51%。結果表明，葛芪平渴丸供試品溶液在 8 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 精密度試驗 取供試品(批號：150112)，按上述供試品制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，RSD%=0.29%。

2.2.8 重復性試驗 取同一批號樣品(批號150112)，按擬定的樣品制備方法制備6份供試品溶液，依法測定含量，RSD%=1.46%。結果表明，本方法重復性良好。

2.2.9 回收率試驗 按加樣回收法進行試驗，取樣品(批號150112)已知含量(葛根素3.1504 mg/g)的供試品適量，分別加入適量的葛根素對照品，按供試品制備方法制備，測定峰面積，以下式計算回收率。結果見表1。

表1 回收率試驗結果

結果表明，本方法回收率良好。

2.2.10 樣品測定 取葛芪平渴丸三批樣品(批號分別為：150112、150114、150116)，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件測定其含量。結果見表2。

表2 葛根素的含量測定結果 (n=3)

薄層色譜(TCL)葛根、黃連、薏苡仁特征斑點清晰，專屬性強，陰性無干擾；葛根素含量在0.196～0.980 μg范圍內進樣量與峰面積線性關系良好(r=0.9998，n=6)，平均回收率為98.68%(RSD=0.68%,n=6)。

根據(jù)樣品測定結果，結合本制劑工藝及藥材含量，暫定本品每克含葛根以葛根素(C21H20O9)計，不得少于2.50 mg。

3 討論

本實驗考察了甲醇、50%乙醇、30%乙醇等不同溶劑提取效果[16-18]，結果顯示：甲醇、50%乙醇、30%乙醇超聲30 min，制備的供試品中葛根素的含量幾乎相同，依照優(yōu)化工藝及節(jié)省資源的原則，結合《中國藥典》2015年版一部，選用30%乙醇作為供試品的制備溶劑。

本實驗還考察了15 min、30 min、45 min等不同超聲時長的影響因素，結果顯示：超聲30 min制備的供試品中葛根素的含量最高，故確定30%乙醇超聲30 min作為制備葛芪平渴丸供試品溶液的方法。

本試驗對處方中葛根、黃連、薏苡仁三味中藥材進行薄層色譜鑒別，對處方中君藥葛根指標性成分葛根素進行含量測定，從而建立該制劑的質量標準。該試驗方法操作簡單、重復性高，結果穩(wěn)定，可用于同種劑型中藥制劑的質量檢測。目前大多數(shù)中藥制劑主要從薄層色譜定性鑒別和高效液相色譜法含量檢測兩方面入手，選取制劑處方中的部分藥材進行檢測，制定其質量標準。

近年來，隨著中藥制劑的現(xiàn)代化發(fā)展及院內制劑的開發(fā)，高效液相色譜法廣泛用于中藥材有效成分的含量檢測，但該方法并不是檢測藥品有效成分含量的唯一方法，氣相色譜法、液-質聯(lián)用法、GC-MS聯(lián)用法、薄層色譜掃描法、核磁共振波普法等檢測方法逐漸運用到中藥有效成分含量的檢測當中，各種方法均具有其優(yōu)缺點；中藥制劑主要為復方制劑，以辨證論治為基礎，根據(jù)中醫(yī)藥理論組方而成，大多數(shù)的院內制劑，為臨床使用的經(jīng)驗方，長期臨床應用療效顯著，不良反應小，深受患者的好評，為了方便患者的服用及攜帶，中藥湯劑被逐漸改良為現(xiàn)代劑型，這就對中藥制劑的質量要求也越來越高，由于中藥材成分復雜，檢測過程中易產(chǎn)生干擾，中成藥中有效成分的檢測更是如此，要求我們優(yōu)化供試品的制備方法，以節(jié)省資源、降低干擾成分、易操作為原則，采用不同的方法，檢測中藥制劑中有效成分及其含量范圍，對確保中藥制劑的質量及穩(wěn)定性生產(chǎn)具有重要意義。

葛芪平渴丸是我院脾胃腎病科名老中醫(yī)的經(jīng)驗方，由葛根、黃連、薏苡仁、熟地黃等十四味中藥材組成，其作用是處方中各味中藥材共同作用的結果，且中藥有效成分復雜多樣，為了更進一步研究發(fā)揮作用的有效成分及物質基礎，在今后的試驗研究中，應從處方中各味中藥材入手，根據(jù)中醫(yī)藥理論及藥物之間的配伍關系，運用多種檢測方法對其進行研究，從而制定更完善的質量標準，為臨床安全使用提供可靠的數(shù)據(jù)和試驗研究資料。