梓醇對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及AMPK/ROS/NF-κB信號(hào)通路的影響

劉嘉研，李俊峰，車 楠，李 莉，姜京植，李良昌

1)延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 吉林延吉 133002 2)吉林省科技廳過(guò)敏性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 吉林延吉 133002

哮喘是一種常見(jiàn)的氣道炎癥性疾病，主要病理特征為氣道高反應(yīng)性、氣道平滑肌收縮、氣道重塑以及黏液分泌過(guò)多，最后導(dǎo)致氣流受限和呼吸困難。氧化應(yīng)激是在體內(nèi)外有害因素刺激下，體內(nèi)自由基產(chǎn)生增加或機(jī)體抗氧化能力減弱，造成的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。氧化應(yīng)激介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠誘導(dǎo)氣道炎癥，導(dǎo)致氣道纖維化、平滑肌細(xì)胞增殖以及肺部黏液量增加，進(jìn)一步加重哮喘[2]。因此，調(diào)控氧化應(yīng)激已成為哮喘治療的研究熱點(diǎn)。梓醇是一種從中藥地黃中提取的環(huán)烯醚萜苷化合物，具有顯著的藥理作用，能夠抑制LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠腦內(nèi)氧化損傷[3]。也有研究[4]證明梓醇通過(guò)減輕嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制哮喘炎癥。本研究中作者利用卵清蛋白誘導(dǎo)建立哮喘小鼠模型，從氧化應(yīng)激角度探討梓醇對(duì)哮喘氣道炎癥的調(diào)控作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑和儀器卵清蛋白、ROS檢測(cè)試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，白介素(interleukin, IL)-4、IL-5和IL-13 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)和磷酸化AMPK(p-AMPK)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，NF-κB(p65)、β-actin和PARP(內(nèi)參)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，梓醇購(gòu)自中國(guó)道斯夫生物公司。402型霧化器(上海四菱醫(yī)療器械廠)，分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司)，氣壓體積描記室(韓國(guó)All Medicus公司)。

1.2哮喘模型建立與分組雌性BALB/c小鼠40只，體重(18±5) g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組，每組10只。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠分別于第1、7、14天腹腔注射200 μL的致敏溶液(含20 μg卵清蛋白+1 mg氫氧化鋁)致敏，正常組以等量生理鹽水代替。第21天將致敏小鼠置于玻璃罩內(nèi)，每組以0.1 g卵清蛋白+10 mL生理鹽水霧化激發(fā)30 min，1次/d，共7 d。梓醇低、高劑量組分別在激發(fā)前1 h灌服梓醇50或100 mg/(kg·d)，共7 d。

1.3氣道高反應(yīng)性檢測(cè)最后一次卵清蛋白激發(fā)4 h后，將清醒的大鼠置于體描室，記錄3 min內(nèi)平均基線讀數(shù)，依次吸入2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 g/L乙酰膽堿20 s，記錄3 min內(nèi)平均讀數(shù)。計(jì)算增強(qiáng)呼氣間歇(%)，用以反映氣道高反應(yīng)性。

1.4實(shí)驗(yàn)樣本獲取及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞檢測(cè)末次激發(fā)48 h后處死小鼠，收集BALF，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，待測(cè)細(xì)胞因子。離心沉淀涂片后Diff-quik染色，鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類。取右肺下葉，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行HE染色。余肺葉放入液氮中速凍，-80 ℃保存待用。

1.5BALF中IL-4、IL-5和IL-13含量測(cè)定按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5、IL-13含量。

1.6肺組織中ROS、SOD和MDA的檢測(cè)取500 mg肺組織樣品制備勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟分別用流式細(xì)胞術(shù)和比色法測(cè)定ROS(以平均熒光強(qiáng)度表示)、SOD以及MDA。

1.7肺組織中p-AMPK、AMPK和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的檢測(cè)取肺組織，裂解獲取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)泳道加樣20 μg總蛋白，在120 g/L SDS-PAGE膠上進(jìn)行蛋白分離(120 V、90 min)，分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h后，分別加入AMPK、p-AMPK和NF-κB(p65)一抗(分別按1∶500、1∶500和1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜。洗膜后再加HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜，加ECL顯色，用Gel Doc進(jìn)行圖像采集。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 14.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)目和炎癥細(xì)胞因子水平，小鼠肺組織中ROS、SOD、MDA含量及AMPK、p-AMPK、NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1梓醇對(duì)哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性的影響4組小鼠氣道高反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠氣道反應(yīng)性均高于正常對(duì)照組；而梓醇低、高劑量組較模型組降低。

表1 4組小鼠氣道高反應(yīng)性比較 %

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.2梓醇對(duì)哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響HE染色結(jié)果(圖1)顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺部明顯存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌增厚和氣道黏膜水腫等哮喘病理特征；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組上皮細(xì)胞增生受抑，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，黏膜水腫改善。

A、B、C、D：分別為正常對(duì)照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

2.3梓醇對(duì)哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組BALF中淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均升高；與模型組比較，梓醇組小鼠炎癥細(xì)胞數(shù)降低，且梓醇高劑量組更低，見(jiàn)表2。

2.4梓醇對(duì)哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的影響結(jié)果見(jiàn)表3。模型組和梓醇低、高劑量組BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平高于正常對(duì)照組;而梓醇低、高劑量組均較模型組降低，其中高劑量組IL-5和IL-13水平更低。

表2 4組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)的比較 ×104個(gè)/mL

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

表3 4組小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平的比較 ng/L

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.5梓醇對(duì)哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激的影響結(jié)果見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組相比，模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺組織勻漿中ROS和MDA含量升高，SOD活力下降，提示哮喘小鼠肺部存在氧化應(yīng)激損傷；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中ROS和MDA含量下降，SOD活力增強(qiáng)，說(shuō)明梓醇尤其是高劑量梓醇能夠減輕哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)。

表4 4組小鼠肺組織中ROS、MDA含量和SOD活性的比較

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

2.6梓醇對(duì)哮喘小鼠肺組織中NF-κB(p65)、p-AMPK表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖2、3，表5。模型組和梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB(p65)表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，p-AMPK表達(dá)水平低于正常對(duì)照組；而與模型組比較，梓醇低、高劑量組小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達(dá)均降低，p-AMPK的表達(dá)均升高，且高劑量組變化更顯著。

1～4：分別為正常對(duì)照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

圖2 4組小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達(dá)

1～4：分別為正常對(duì)照組、模型組、梓醇低劑量組、梓醇高劑量組

圖3 4組小鼠肺組織中p-AMPK的表達(dá)

*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與梓醇低劑量組比較，P<0.05

3 討論

哮喘是最常見(jiàn)的慢性非傳染性疾病之一，其特征為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道黏膜水腫、氣道上皮剝脫、膠原沉積和反復(fù)發(fā)作的氣道阻塞[5]。哮喘發(fā)病過(guò)程分泌大量的Th2類細(xì)胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，這些細(xì)胞因子能夠趨化嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致氣管和氣道黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)氣道平滑肌收縮，誘發(fā)哮喘臨床癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，梓醇能夠抑制哮喘小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)BALF中炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13的水平，減輕肺部病理改變以及氣道高反應(yīng)性，提示梓醇具有抑制哮喘氣道炎癥的作用。

哮喘進(jìn)展過(guò)程中，由炎癥細(xì)胞活化產(chǎn)生的過(guò)量ROS發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ROS觸發(fā)細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物。MDA水平越高，代表ROS水平越高，機(jī)體損傷越重。正常條件下，機(jī)體通過(guò)抗氧化酶如SOD等降低ROS水平[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中ROS和MDA含量升高，而SOD活性下降，表明哮喘小鼠肺部存在氧化應(yīng)激，而梓醇能夠提高哮喘小鼠肺部SOD活性，降低ROS和MDA含量，提示梓醇能夠減輕哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)。

機(jī)體內(nèi)存在調(diào)控ROS的多條信號(hào)，如核因子E2相關(guān)因子2和AMPK等。AMPK是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，是細(xì)胞能量代謝和氧化還原的感受調(diào)節(jié)器，具有調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、抗增殖重塑等生物學(xué)功能，是治療多種疾病的潛在靶位[6]。Faubert等[7]研究表明，AMPK缺陷的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞線粒體中ROS水平迅速升高。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)梓醇治療后哮喘小鼠肺組織中AMPK磷酸化水平升高，提示梓醇可能通過(guò)上調(diào)AMPK活性來(lái)降低ROS水平。ROS在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和許多轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α、NF-κB和激活蛋白1[8]。NF-κB存在于大多數(shù)細(xì)胞類型中，并且在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。炎癥條件下，NF-κB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，調(diào)控多種編碼炎癥蛋白的靶基因轉(zhuǎn)錄，如炎癥因子IL-4、IL-5和IL-13[5]。本研究發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制哮喘小鼠肺組織中NF-κB(p65)的表達(dá)，提示梓醇可能通過(guò)下調(diào)ROS水平抑制NF-κB(p65)的表達(dá)。

綜上所述，梓醇可通過(guò)下調(diào)AMPK的表達(dá)調(diào)控ROS的生成，減輕哮喘小鼠肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過(guò)ROS/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控哮喘小鼠氣道炎癥因子的釋放，抑制哮喘氣道炎癥。