金線蓮及其混偽品中總黃酮含量的比較研究

張 超，易 駿，張若青，楊淑玲，葉 齊，吳建國(guó)，吳錦忠，吳巖斌，鄭承劍

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122；2.福建教育學(xué)院理科部,福建 福州 350001；3.中國(guó)人民解放軍天津康復(fù)療養(yǎng)中心464醫(yī)院藥劑科，天津 300381；4.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；5.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，上海 200433)

金線蓮(Herba Anoectochilus)是福建特色中草藥，來源于蘭科(Orchidaceae)金線蘭屬植物金線蘭Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl.的全草，具有清熱解毒、涼血、祛風(fēng)利濕等功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明金線蓮具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、保肝、抗骨質(zhì)疏松等藥理作用[3-11]。除金線蘭外，其他金線蘭屬植物包括：臺(tái)灣銀線蘭A.formosanus、恒春銀線蘭A.koshunensis、浙江金線蘭A.zhejiangensis、峨眉金線蘭A.emeiensis、滇越金線蘭A.chapaensis等，金線蘭屬植物在民間也混做金線蓮使用[12-13]。另外，由于藥材形態(tài)特征相似，在市場(chǎng)上常有一些同科不同屬近緣種植物如：斑葉蘭屬植物斑葉蘭GoodyeraschlechtendalianaRchb.f.、大花斑葉蘭G.biflora(Lindl.) Hook.f.、毛梗斑葉蘭G.hispidaLindl.、小小斑葉蘭G.yangmeishanensiT.P.lin、天全斑葉蘭G.wuanaT.Tang et F.T.wang、血葉蘭屬植物血葉蘭Ludisiadiscolor(Ker-Gawl.) A.Rich.，經(jīng)過干燥加工后作為金線蓮的偽品[13]。黃酮類成分是金線蓮主要的活性成分之一，具有抗氧化和降血糖等生物活性，也是衡量該藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)[14-15]。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道過金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭和滇越金線蘭中的黃酮類成分[12,16-17]，但是關(guān)于其他金線蓮混偽品中黃酮類成分卻鮮見報(bào)道。本研究分析金線蓮及其混偽品中總黃酮含量的差異，將為金線蓮資源的開發(fā)利用和藥材質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；AB204-N電子天平(METTLER TOLEDO)；DFT-200手提式高速萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

1.2 試劑

金線蓮及其混淆品采自不同省市，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室黃澤豪教授鑒定；蘆丁(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：15010412，含量大于98%)；硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇為分析純；蒸餾水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.38 mg,置25 ml 容量瓶中，加10 ml乙醇溶解，加水至刻度，搖勻，即得每1 ml 中含蘆丁0.2152 mg 的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取不同樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加70 ml石油醚加熱回流提取至提取液無色，棄去石油醚液，藥渣揮去石油醚，加95%乙醇繼續(xù)提取至無色，提取液旋轉(zhuǎn)濃縮至干，加入95%乙醇超聲溶解，定容，得總黃酮上清液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置25ml容量瓶中，加水至6.0ml，再加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度(C)為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到總黃酮含量測(cè)定的回歸方程：A=0.0111C-0.0097(r= 0.9996)，結(jié)果表明蘆丁在8.61～51.65 μg/ml范圍內(nèi)線性良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的蘆丁對(duì)照品溶液(215.2 μg/ml)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,計(jì)算結(jié)果顯示6份蘆丁對(duì)照品反應(yīng)后的吸光度的RSD為0.46%，表明該方法的精密度良好。

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品(序號(hào)8)1.0 g，平行稱取6份，按“2.2”項(xiàng)下處理，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,計(jì)算結(jié)果顯示6份金線蓮樣品總黃酮反應(yīng)體系的吸光度RSD為2.66%，表明該方法測(cè)定金線蓮總黃酮的含量重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品(序號(hào)8)1.0g，按“2.2”項(xiàng)下處理，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，分別每隔10 min記錄吸光度,計(jì)算結(jié)果顯示該金線蓮總黃酮反應(yīng)體系的吸光度在120 min內(nèi)RSD為0.97%，表明該反應(yīng)體系在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4回收率試驗(yàn)

取已知含有量的樣品(序號(hào)8)0.5 g，平行稱定6份，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法提取總黃酮，分別取3 ml供試液置于6支25 ml容量瓶中，再分別加入2.37 mg蘆丁對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度,并計(jì)算總黃酮含量，計(jì)算回收率和RSD?；厥章式Y(jié)果見表1，結(jié)果顯示，金線蓮總黃酮的平均回收率為98.85%，RSD為2.91%，表明金線蓮總黃酮的加樣回收率良好。

表1 金線蓮總黃酮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量的測(cè)定

精密吸取供試品溶液3 ml置25 ml容量瓶中，照“2.3”項(xiàng)下的方法，自“加水至6.0 ml”起，依法測(cè)定吸光度，每批樣品平行3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果見表2。

7批來源于野生金線蓮的樣品總黃酮含量在5.90～15.17 mg/g之間，均值為9.93 mg/g，RSD為33.04%，來源于廣東清遠(yuǎn)的野生金線蓮樣品總黃酮含量最高，為15.17 mg/g；5批組培金線蓮樣品的總黃酮含量在3.89～5.57 mg/g之間，均值為4.50 mg/g，RSD為15.33%；5批組培臺(tái)灣銀線蘭樣品的總黃酮含量在3.66～9.91 mg/g，均值為6.59 mg/g，RSD為44.30%；其余7種野生金線蘭屬樣品總黃酮含量在6.88～9.19mg/g之間；4種斑葉蘭屬植物(斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、天全斑葉蘭)和1種血葉蘭屬植物(血葉蘭)，它們的總黃酮含量分別為21.96、9.66、11.10、12.70和4.82mg/g。

表2 金線蓮及其混偽品中總黃酮的含量(n=3)

注：AR 8-12分別是來自不同企業(yè)的組培金線蘭；AF 1-5分別是來自不同企業(yè)的組培臺(tái)灣銀線蘭；其余樣品均為野生。

3 討論和結(jié)論

金線蓮已成為福建省特色中藥材“福九味”之一，但其來源混雜、混偽品多，導(dǎo)致藥材質(zhì)量良莠不齊，影響到臨床用藥的有效性和安全性。目前，市場(chǎng)上金線蓮的主要偽品為斑葉蘭屬植物和血葉蘭的全草，主要的混淆品或地方習(xí)用品為臺(tái)灣銀線蘭、滇越金線蘭等金線蘭屬植物。本研究采集了30批次不同來源的金線蓮及其混淆品和偽品，包括金線蘭、臺(tái)灣銀線蘭、興仁金線蘭、麗蕾金線蘭、南丹金線蘭、長(zhǎng)片金線蘭、滇南金線蘭、短唇金線蘭、高金線蘭、斑葉蘭、大花斑葉蘭、小小斑葉蘭、天全斑葉蘭、血葉蘭，其中短唇金線蘭和高金線蘭為課題組在中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的金線蘭屬植物，其植物形態(tài)與金線蘭極其相似，在云南省也被當(dāng)作金線蓮使用[18-19]。

金線蓮為全草類中藥，色素較多，本試驗(yàn)通過石油醚回流提取后，再采用乙醇提取總黃酮，可以減少其他類成分對(duì)總黃酮含量測(cè)定的干擾。試驗(yàn)結(jié)果顯示，金線蓮及其混淆品、偽品的總黃酮含量存在差異。12批次的金線蓮總黃酮含量在3.89～15.17 mg/g之間，其余金線蓮混淆品和偽品的總黃酮含量在3.66～21.96 mg/g之間。不同產(chǎn)地的野生金線蓮總黃酮含量存在差異，這可能與其生長(zhǎng)年限和生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)；不同廠家的組培金線蓮和臺(tái)灣銀線蘭的總黃酮含量差別較大，這可能與不同廠家生產(chǎn)組培品所用的外植體不同有關(guān)，此外組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、光照、溫度等也可能對(duì)總黃酮的積累產(chǎn)生影響；金線蓮與其混淆品、偽品中總黃酮的含量差異可能與種的不同及其生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。黃酮含量的高低，僅可作為金線蓮質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一，若要全面地評(píng)價(jià)金線蓮的質(zhì)量,還應(yīng)當(dāng)對(duì)其多糖、內(nèi)酯苷等成分進(jìn)行系統(tǒng)的研究。