Hartley豚鼠SPF級(jí)核心種群生長(zhǎng)曲線(xiàn)與血液生理生化指標(biāo)測(cè)定*

武衛(wèi)國(guó) 范 濤 王 洪 王學(xué)文 劉佐民 柳全明

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

豚鼠原產(chǎn)于南美洲西北部，16世紀(jì)作為寵物由西班牙人帶入歐洲。20世紀(jì)20年代后期，英國(guó)培育的短毛豚鼠Dunkin-Hartley是最早用于實(shí)驗(yàn)的品系?，F(xiàn)今，豚鼠已經(jīng)成為最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，在生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著不可替代的作用[1]。

Hartley豚鼠屬封閉群品系，本單位所保持的Hartley豚鼠是1994年由日本引進(jìn)，白化，清潔級(jí)(CL)，一直封閉繁育至今。近幾年，通過(guò)剖腹產(chǎn)凈化的方式對(duì)種群的微生物級(jí)別進(jìn)行了提升，從清潔級(jí)上升至SPF級(jí)，并維持在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，構(gòu)建了SPF級(jí)豚鼠核心種群，并逐步擴(kuò)大生產(chǎn)。對(duì)于封閉群動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制，主要表現(xiàn)在保持其遺傳組成具有較高的雜合性，使個(gè)體間存在較大的遺傳性狀差異，同時(shí)所有基因的相對(duì)頻率保持穩(wěn)定。而在剖腹產(chǎn)凈化建立SPF種群時(shí)，用于剖腹產(chǎn)的豚鼠相對(duì)較少，改變了群體等位基因的頻率，對(duì)群體的遺傳特性造成重大改變。因此，重新建立一套清晰、明確的生物學(xué)背景數(shù)據(jù)作為各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中的參照具有其必要性。

本研究通過(guò)對(duì)Hartley豚鼠核心群生長(zhǎng)體質(zhì)量的監(jiān)測(cè)，以及血液樣本生理生化指標(biāo)的測(cè)定，進(jìn)一步完善該封閉群豚鼠的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)與特性，為該群體遺傳質(zhì)量的維持以及日后的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要設(shè)備和耗材:電子秤(上海良平儀器儀表有限公司B10002，中國(guó))；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(NIHON KOHDEN CelltacE MEK-7222，日本)；全自動(dòng)生化分析儀(Olympus AU400，日本)；離心機(jī)(Eppendorf X22，德國(guó))；0～100 μL微量移液器(Eppendorf，德國(guó))；1.5 mL離心管(Axygen，美國(guó))；1.5 mL EDTA-K2霧化抗凝管(國(guó)產(chǎn))；2 mL無(wú)菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司，中國(guó))；血液生理生化檢測(cè)相關(guān)試劑由本單位實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:取Hartley豚鼠SPF級(jí)核心群中健康個(gè)體，50只，體質(zhì)量250～300 g，雌、雄各半，每個(gè)繁殖單元至少選擇1雄1雌，由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0013。豚鼠核心群飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，開(kāi)放籠盒，環(huán)境參數(shù)：溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，潔凈度7級(jí)，明暗交替12/12 h。飼養(yǎng)期間飼喂市售60Co輻照滅菌全價(jià)生長(zhǎng)繁殖飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，高壓滅菌水(pH 7)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豚鼠稱(chēng)質(zhì)量:電子秤使用前調(diào)至水平并用砝碼進(jìn)行校準(zhǔn)。豚鼠出生當(dāng)日記為第0 d，剪耳標(biāo)號(hào)，逐日進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量并記錄，7 d后離乳，雌、雄分籠飼養(yǎng)(<350 g時(shí)10只/籠，≥350 g時(shí)5只/籠，籠盒尺寸：78 cm×48 cm×24 cm)，自由采食全價(jià)飼料及飲水，體質(zhì)量記錄至8周齡。

1.2.2豚鼠采血:250～300 g豚鼠通過(guò)心臟穿刺法采集血液，采血前禁食12 h，不禁水。一人抓取豚鼠保定，暴露胸口，另一人用2 mL注射器，觸摸胸口心搏最強(qiáng)處進(jìn)針，緩慢抽取，采集1.5～2 mL血液。約1 mL血液注入霧化EDTA-2 K抗凝管中，充分顛倒混勻，用于血液生理指標(biāo)的測(cè)定；其余注入普通離心管，室溫20～25℃靜置2～3 h析出血清，3 000 r/min，離心10 min，吸取上清至新管，-20℃凍存，用于血液生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3血液生理生化指標(biāo)測(cè)定:用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)抗凝血液樣本進(jìn)行逐一檢測(cè)，項(xiàng)目包括：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞積壓(HCT)紅細(xì)胞體積(MCV)、血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MON)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(BAS)等；將各血清樣本室溫解凍，取300 μL置于生化管內(nèi)，放入全自動(dòng)血液生化分析儀中進(jìn)行檢測(cè)，項(xiàng)目包括：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(CA)、磷(P)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)等。

1．3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2．1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

豚鼠0～8 周齡體質(zhì)量稱(chēng)量結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)體質(zhì)量變化數(shù)據(jù)，分別繪制雌、雄生長(zhǎng)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖1。

表1 Hartley豚鼠0～8周齡體質(zhì)量(g)Table 1 Body weight of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age(g)

圖1 Hartley豚鼠0～8周齡生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curves of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age

2．2 Hartley豚鼠血液生理測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)出血液生理指標(biāo)見(jiàn)表2。Hartley豚鼠血常規(guī)指標(biāo)中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)3項(xiàng)指標(biāo)，在雌性與雄性間有顯著性差異(P<0.05)。血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)在雌、雄性別間表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表2 Hartley豚鼠血液生理指標(biāo)Table 2 Blood physiological indexes of Hartley guinea pigs

2．3 Hartley豚鼠血液生化測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)13項(xiàng)生化指標(biāo)，見(jiàn)表3。生化常規(guī)指標(biāo)中，堿性磷酸酶(ALP)兩性別間有顯著性差異(P<0.05)，雄性顯著高于雌性。尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、膽固醇(CHO)3項(xiàng)指標(biāo)，兩性別間差異極顯著(P<0.01)，其中尿素氮、肌酐雄性極顯著高于雌性，而膽固醇水平雄性極顯著低于雌性。其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表3 Hartley豚鼠血液生化指標(biāo)Table 3 Blood biochemical indexes of Hartley guinea pigs

2．4 SPF級(jí)與清潔級(jí)豚鼠各參數(shù)比較結(jié)果

根據(jù)2009年本單位所測(cè)得的清潔級(jí)Hartley豚鼠血液生理生化指標(biāo)[2]進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表4。通過(guò)11項(xiàng)血液生理指標(biāo)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在雄性SPF級(jí)與CL級(jí)豚鼠中除白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)差異不顯著(P>0.05)外，其他指標(biāo)均存在極顯著差異(P<0.01)；而雌性豚鼠中，紅細(xì)胞體積(MCV)與血小板計(jì)數(shù)(PLT)兩項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著差異(P>0.05)，其他指標(biāo)均存在極顯著的差異(P<0.01)。差異顯著的指標(biāo)中，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、血小板容積(MPV)等指標(biāo)SPF級(jí)豚鼠顯著低于清潔級(jí)。

表4 SPF級(jí)與清潔級(jí)Hartley豚鼠血液生理生化指標(biāo)比較Table 4 Comparison of hematological parameters between SPF and CL Hartley guinea pigs

在對(duì)9項(xiàng)血液生化指標(biāo)比較中，除兩種級(jí)別雄性豚鼠血鈣含量差異顯著(P<0.05)外，其他指標(biāo)在SPF級(jí)與清潔級(jí)豚鼠間存在極顯著差異(P<0.01)。差異極顯著的指標(biāo)中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)等，SPF級(jí)豚鼠都顯著低于清潔級(jí)，其他指標(biāo)高于清潔級(jí)。

3 討論

血液生理生化指標(biāo)在臨床、實(shí)驗(yàn)中有著重要意義，是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用中的重要基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)[3-7]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了Hartley豚鼠SPF級(jí)核心種群的生長(zhǎng)曲線(xiàn)以及血液生理生化指標(biāo)，為該群的日后應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。該種群在作者所在單位已飼養(yǎng)傳代多年，并且通過(guò)剖腹產(chǎn)凈化將種群的微生物等級(jí)上升至SPF級(jí)，其血液生理生化指標(biāo)已發(fā)生了重大改變，通過(guò)與2009年的數(shù)據(jù)對(duì)比，11項(xiàng)血液生理指標(biāo)、9項(xiàng)血生化指標(biāo)都表現(xiàn)出極顯著差異。動(dòng)物所處的環(huán)境，飼料、飲水種類(lèi)以及飼養(yǎng)密度方式等均對(duì)血液生理生化值產(chǎn)生著影響。SPF級(jí)豚鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，溫度維持在20～26 ℃、相對(duì)濕度40%～70%，空氣潔凈度控制在萬(wàn)級(jí)(7級(jí))，所用籠具、飼料、飲水等物品均經(jīng)過(guò)高壓或輻照滅菌處理，同時(shí)，飼養(yǎng)人員在接觸動(dòng)物前均要進(jìn)行淋浴，更換滅菌服，因此，SPF級(jí)豚鼠接觸到外界抗原的幾率較普通級(jí)與清潔級(jí)動(dòng)物大幅降低，致使其參與免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞顯著減少，在血液生理指標(biāo)中SPF級(jí)豚鼠淋巴細(xì)胞數(shù)量與淋巴細(xì)胞百分比極顯著低于清潔級(jí)，這與張琨等[4]、鄺少松等[5]、張曉玉等[6]相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果相一致。

環(huán)境微生物的差異同時(shí)會(huì)導(dǎo)致腸道微生物菌群的改變，使得豚鼠對(duì)蛋白、糖類(lèi)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝發(fā)生變化[8-9]，進(jìn)而影響血液生化中部分指標(biāo)在SPF級(jí)與清潔級(jí)豚鼠間存在顯著差異，比如堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)等。豚鼠屬草食性動(dòng)物，對(duì)粗纖維消化能力強(qiáng)，同時(shí)，體內(nèi)缺乏左旋葡萄糖內(nèi)酯氧化酶而不能合成維生素C[10]。在GB 14924.5—2001中[11]，豚鼠生長(zhǎng)繁殖與維持飼料中的粗纖維含量都要求在10%～15%，維持飼料中Vc含量≥1 500 mg/kg(繁殖料≥1 800 mg/kg)。保持全價(jià)飼料中粗纖維比例與Vc含量是飼養(yǎng)管理中關(guān)注的重點(diǎn)，同時(shí)也是維持SPF級(jí)豚鼠正常血液生理生化指標(biāo)的重要因素。

在相同環(huán)境下，SPF級(jí)豚鼠血液參數(shù)在性別之間也存在著差異，如血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)兩項(xiàng)指標(biāo)，雌性豚鼠都極顯著低于雄性豚鼠；生化指標(biāo)中，堿性磷酸酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、膽固醇(CHO)在兩性別間也表現(xiàn)出顯著與極顯著差異，由此說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)豚鼠的微生物級(jí)別、飼養(yǎng)環(huán)境、性別、周齡等都是其生理指標(biāo)的影響因素，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同影響，在日后的應(yīng)用中應(yīng)有所選擇。

本豚鼠群是通過(guò)對(duì)清潔級(jí)豚鼠進(jìn)行剖腹產(chǎn)凈化擴(kuò)繁而來(lái)，剖腹產(chǎn)建群是由少數(shù)孕鼠中獲得后代，再經(jīng)過(guò)幾代形成一定規(guī)模，由于“奠基者”效應(yīng)的影響，使得新群體的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生遺傳性狀的漂移[12]。封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育原則是盡量避免近交，同時(shí)維持該群體的遺傳穩(wěn)定性，然而在現(xiàn)有的繁育體系下，即使保持著足夠數(shù)量的群體有效含量以及較低近交上升速率，也無(wú)法阻止遺傳漂變的產(chǎn)生。因此，遺傳性狀的定期監(jiān)測(cè)更顯示出其必要性。群體各項(xiàng)生物學(xué)數(shù)據(jù)的正常值不僅僅是從當(dāng)前群體獲得，而是需要多年的數(shù)據(jù)積累，重新測(cè)定的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)有很多屬于遺傳力高的性狀，通過(guò)檢測(cè)，不僅了解了當(dāng)前群體的特性，同時(shí)有助于新建立群體的遺傳學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià)，為“二次優(yōu)選法”糾正遺傳漂變提供數(shù)據(jù)支持。